激光輔助孵化在玻璃化凍融胚胎移植周期中的應用

趙芳，呂玉珍，王娟，田可可

（河南省焦作市婦幼保健院生殖中心，焦作 454000）

近年來體外受精-胚胎移植技（IVF-ET）術飛速發展，但較低的臨床妊娠率和胚胎種植率仍然是生殖醫學工作者面臨的難題。囊胚期胚胎移植技術可通過選擇發育潛能較高的胚胎以提高胚胎種植率，減少移植胚胎數。激光輔助孵化（laser assisted hatching，LAH）應用于凍融胚胎移植（FET）中已有多年，但能否有助于提高臨床妊娠率和胚胎種植率，目前尚有爭議。本研究分析囊胚移植結合LAH 在玻璃化凍融周期中的應用，旨在探討提高胚胎種植率的方法。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2013年5月至2014年10月期間在河南省焦作市婦幼保健院生殖中心行玻璃化凍融移植的639個周期，患者新鮮周期移植失敗或因各種原因新鮮周期未移植行全胚冷凍。根據解凍胚胎天數以及是否行LAH，分為4組：A 組（解凍D3胚胎，行LAH）、B組（解凍D3胚胎，不行LAH）、C組（解凍D6囊胚，行LAH）、D 組（解凍D6囊胚，不行LAH）。排除標準：子宮內膜薄、子宮內膜異位癥、輸卵管積水、染色體異常、生殖系統畸形、解凍5期和6期囊胚［1］的患者。

二、研究方法

1.促排卵及IVF-ET：采用本中心常規方法進行促排卵、取卵、體外受精和胚胎培養（Quinn’s 系列，Sage，美國）。根據卵裂球均勻度、碎片比例和發育速度等進行胚胎質量評估。D3選擇2～3枚胚胎移植，移植后剩余的胚胎經患者知情同意后，冷凍保存或繼續培養至D5／D6形成囊胚后冷凍保存。囊胚評分依據Gardner評分標準［1］。FET 子宮內膜的準備方案采用自然周期或激素替代周期。

2.胚胎的玻璃化冷凍：囊胚在冷凍前行激光法人工皺縮，待囊腔近完全皺縮后冷凍。使用Medi?ult試劑盒（Origio，丹麥），室溫下先將胚胎轉移入基礎（BS）液，1 min后轉移至平衡（ES）液，在ES液中平衡時間卵裂期胚胎為3～5min，囊胚為5～8min。再將胚胎轉移至玻璃化（VS）液，60s 內將胚胎裝載至冷凍載桿（Medicult）上，投入液氮保存。

3.玻璃化冷凍胚胎的解凍：將裝載有胚胎的載桿放入37℃預溫的解凍液WS1，胚胎在WS1液中停留1min，依次轉移胚胎至解凍液WS2、3、4液各停留3min，將胚胎轉移入平衡好的10% 人血清白蛋白（HSA）1029 微滴中。解凍后胚胎復蘇的細胞數≥50%總細胞數為胚胎復蘇的標準，復蘇率＝復蘇胚胎數／解凍胚胎數。

4.LAH 及胚胎移植：卵裂期胚胎解凍后2～3h移植，在移植前1h 行LAH，使用非接觸式激光顯微操作系統（OCTAX，德國），選取卵周間隙相對較大或碎片較多的區域，調整激光靶心使其位于削薄區透明帶外緣，點擊激光發射鍵，形成寬度為1／4透明帶周長、深度為透明帶厚度2／3 的薄化區。5期以下囊胚在解凍后立即行LAH，在卵周間隙較大的區域削除1／4透明帶周長［2］，移入移植皿中繼續培養2～3h至移植。移植后給予黃體支持，移植后14d驗血HCG，移植后30dB超見孕囊為臨床妊娠。

5.觀察指標：復蘇率、臨床妊娠率、胚胎種植率、多胎率、流產率、異位妊娠率。

三、統計學處理

結 果

一、患者一般情況的比較

A 組和B 組患者的年齡、平均ET 胚胎數均高于C組和D 組（P＜0.05）。四組患者ET 日子宮內膜厚度、復蘇率、不孕因素、受精方式和內膜準備方案均無統計學差異（P＞0.05）（表1）。

二、患者妊娠結局的比較

C組和D 組患者的臨床妊娠率、胚胎種植率顯著高于A 組和B組（P＜0.05）；A 組與B 組的臨床妊娠率、胚胎種植率和多胎率均無統計學差異（P＞0.05）；C 組的胚胎種植率和多胎率顯著高于D 組（P＜0.05）；四組患者的流產率、異位妊娠率均無統計學差異（P＞0.05）（表2）。

表1 四組患者一般情況的比較［（±s），n（%）］

表1 四組患者一般情況的比較［（±s），n（%）］

注：與A 組、B組比較，＊P＜0.05

組 別 例數 年齡（歲） 不孕年限（年） 原發不孕 繼發不孕IVF A 組 181 31.51±5.56 4.30±3.75 81（45.30） 99（54.70） 108（59.67）B組 304 30.56±5.30 4.03±3.31 158（51.97） 146（48.03） 178（58.55）C組 81 27.32±3.59＊ 3.11±1.84＊ 44（54.32） 37（45.68） 48（59.26）D 組 73 27.92±3.94＊ 3.60±2.81 44（60.27） 29（39.73） 44（60.27）組 別 例數 ICSI 自然周期 激素替代周期 復蘇率 ET 日內膜厚度（mm）ET 胚胎數（枚）A 組 181 73（40.33） 45（24.86） 136（75.14） 412／417（98.80）9.36±1.84 2.29±0.52 B組 304 126（41.45） 80（26.32） 224（73.68） 726／735（98.78） 9.69±1.83 2.38±0.52 C組 81 33（40.74） 24（29.63） 57（70.37） 153／153（100.00） 9.36±1.65 1.89±0.32＊D 組 73 29（39.73） 20（27.40） 53（72.60） 142／142（100.00） 9.81±1.52 1.96±0.20＊

表2 四組患者妊娠結局的比較［n（%）］

討 論

近年來，人類輔助生殖技術的進步為不孕癥患者帶來了福音，但目前IVF-ET 的胚胎種植率仍相對較低，是生殖醫學中需要解決的瓶頸問題。本文通過比較卵裂期胚胎與囊胚凍融移植周期中LAH對妊娠結局的影響，旨在探討提高胚胎種植率的方法。

隨著胚胎培養體系和條件的逐漸改善，囊胚培養和移植在IVF 中得到了廣泛的應用。延長胚胎體外培養的時間更有利于選擇出具有發育潛能的胚胎。而且，囊胚細胞數目多，凍融后即使有少數細胞死亡，對胚胎的發育潛能影響也較?。?］。本結果表明，囊胚與卵裂期胚胎都達到了較高的復蘇率，兩者比較無統計學差異（P＞0.05），提示囊胚與卵裂期胚胎均適用于玻璃化冷凍。有研究［4-5］報道，與卵裂期胚胎比較，凍融囊胚復蘇移植周期具有更高的種植率、臨床妊娠率，而流產率、早產率及新生兒出生缺陷率無明顯差異。本研究結果與之報道一致。囊胚凍融移植組（C、D 組）的平均移植胚胎數低于卵裂期胚胎凍融移植組（A、B 組），但臨床妊娠率和胚胎種植率均高于A 組和B 組（P＜0.05），說明凍融周期中，與卵裂期胚胎比較，囊胚移植可獲得更好的臨床結局。林明媚等［6］報道，囊胚移植比D3 胚胎移植流產風險降低。本研究中，四組患者采用相同的黃體支持方案，囊胚組（C、D 組）的流產率略低于卵裂期胚胎組（A、B組），但無統計學差異。

LAH 技術是人為地對透明帶進行薄化、打孔或者去除，以提高胚胎的孵出和種植能力。LAH具有胚胎暴露時間短、定位準確、快速有效、相對安全等優勢，近年來被廣泛應用。由于卵裂期胚胎和囊胚具有不同的特點，本研究對其采用不同的方法行LAH。卵裂期胚胎透明帶間隙小，完全打斷透明帶容易造成卵裂球損傷，采用LAH 削薄部分透明帶更安全，結局更好［7］。本研究中對卵裂期胚胎采用透明帶部分削薄，可以保存透明帶對卵裂期胚胎的保護作用，又使胚胎形成囊胚后易于孵出。關于LAH 對凍融胚胎移植周期的臨床結局的影響，目前意見不一［8-9］。本研究結果提示，卵裂期胚胎凍融移植組中，輔助孵化組（A 組）的臨床妊娠率和胚胎種植率略高于未行輔助孵化組（B 組），但無統計學差異（P＞0.05），與洪焱等［10］報道結果一致。人類透明帶由內外兩層構成，其中內層致密，在囊胚發育過程中不易薄化和擴張。采用激光削薄方法行輔助孵化僅將透明帶外層結構薄化，內層結構仍然完整，并不能有效幫助胚胎孵出和種植，這可能是出現本研究結果的原因。因此，本研究提示，LAH 并不能提高玻璃化凍融卵裂期胚胎的臨床妊娠率和胚胎種植率，不必對所有玻璃化凍融的卵裂期胚胎常規行LAH。

本研究對象未納入解凍5期 和6期囊胚的患者，排除了囊胚自然孵出的影響。有研究顯示，對胚胎行LAH 更適合選擇在囊胚期［11-12］，且在玻璃化凍融囊胚移植周期中應用長透明帶切割技術后，囊胚的完全孵出率、胚胎種植率和臨床妊娠率均高于傳統的部分透明帶切割法［13］，提示對囊胚行LAH時，開孔較大有利于囊胚的順利孵出。本研究中囊胚解凍后立即行LAH，采用激光削除1／4周長的透明帶，此時透明帶與皺縮的內細胞團間空隙很大，操作簡單且不會損傷囊胚的滋養外胚層和內細胞團，透明帶開孔大，有利于囊胚順利孵出，而且內細胞孵出時不易嵌頓，理論上降低了單卵雙胎的發生率。凍融后立即行LAH 也有利于細胞內冷凍保護劑更好擴散，有利于增加囊胚與子宮內膜間的對話和相互作用。本研究數據顯示，囊胚凍融移植組中行LAH 組（C組）患者的胚胎種植率和多胎率顯著高于未行LAH 組（D 組），差異有統計學意義（P＜0.05），其臨床妊娠率稍高于未行LAH 組（D 組），但無統計學差異（P＞0.05）。提示囊胚解凍后行LAH 后可提高胚胎種植率，但多胎率較高，建議今后行凍融單囊胚移植，降低移植胚胎數目，從而降低多胎率。四組患者的異位妊娠率均較低，無統計學差異（P＞0.05）。關于LAH 帶來的熱效應對胚胎和子代的遠期影響，尚有待進一步大樣本的研究。

綜上所述，LAH 并不能提高卵裂期胚胎的臨床妊娠率和胚胎種植率，不必對所有玻璃化凍融的卵裂期胚胎常規行LAH。在玻璃化凍融周期中應用囊胚移植結合LAH 可提高患者的胚胎種植率，達到較好的臨床妊娠結局。

［1］ Gardner DK，Lane M，Stevens J，et al.Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome：towards a single blastocyst transfer［J］.Fertil Steril，2000，73：1155-1158.

［2］ Wan CY，Song C，Diao LH，et al.Laser-assisted hatching improves clinical outcomes of vitrified-warmed blastocysts developed from low-grade cleavage-stage embryos：a prospective randomized study［J／OL］ .Reprod Biomed Online，2014，28：582-589.

［3］ 王雪，甄璟然，孫正怡，等.囊胚發育速度對凍融移植結局的影響［J］.生殖醫學雜志，2014，23：356-360.

［4］ 陳小燕，趙純，凌秀鳳.凍融卵裂期胚胎復蘇移植和凍融囊胚復蘇移植的臨床結局比較［J］.南京醫科大學學報（自然科學版），2014，34：1587-1589.

［5］ 伍瓊芳，丁濤，胡毅娜，等.1658 例玻璃化凍融周期的臨床結局分析［J］.江西醫藥，2014，49：570-573.

［6］ 林明媚，羅璐，李濤，等.囊胚和卵裂期胚胎的早期胚胎流產率比較［J］.生殖與避孕，2013，33：311-316.

［7］ Ghobara TS，Cahill DJ，Ford WC，et al.Effects of assisted hatching method and age on implantation rates of IVF and ICSI［J／OL］.Reprod Biomed Online，2006，13：261-267.

［8］ 谷瑞環，張愛軍，孫貽娟，等.激光輔助孵化對凍融胚胎移植臨床結局的影響［J］.上海交通大學學報（醫學版），2012，32：485-490.

［9］ 李脈，周黎明，孫亦婷，等.激光透明帶削薄技術對凍融胚胎移植臨床結局的影響［J］.生殖醫學雜志.2013，22：658-662.

［10］ 洪焱，劉敏利，駱榮，等.激光輔助孵化對快速玻璃化凍融妊娠結局的影響［J］.中國計劃生育學雜志，2011，19：165-167.

［11］ Miyata H，Matsubayashi H，Fukutomi N，et al.Relevance of the site of assisted hatching in thawed human blastocysts：a preliminary report［J］.Fertil Steril，2010，94：2444-2447.

［12］ 呂祁峰，匡延平，李艷萍，等.人胚胎透明帶順應性及其開孔所致孵化干擾［J］.中山大學學報（醫學科學版），2009，30：55-60.

［13］ Sun ST，Choi JR，Son JB，et al.The effect of long zona dissection using ICSI pipettes for mechanical assisted hatching in vitrified-thawed blastocyst transfers［J］.J Assist Reprod Genet，2012，29：1431-1434.