人卵泡液抑制素B的分離與鑒定

杜江，辛玲，郭穎，周芳＊，于和鳴＊

（1.北京協和醫學院研究生院，北京 100730；2.國家衛生計生委科學技術研究所，北京 100081）

據世界衛生組織報道，21世紀男性不育將會是危害人類健康的最嚴重疾病之一，男性不育因素占不孕不育的40%，且影響男性生育力的危險因素仍在增加［1］。抑制素B（INH-B）的檢測在男性不育癥的診治中已逐漸得到廣泛的應用［2］。研究表明，INH-B是一類糖蛋白激素，因可抑制卵泡刺激素（FSH）分泌而得名。男性體內INH 的重要生理活性形式為INH-B，其組裝過程大部分在生精細胞內完成，然后釋放到循環系統和精液中［3-4］。女性卵泡液中INH-B的含量為幾十ng／ml至幾百ng／ml，比血液及精液中的含量高約103倍［5-6］。而對于人卵泡液及精液中INH-B的相關研究屈指可數［7］，并且對于其存在形式和理化性質并沒有確切的研究結果。究其原因主要是由于卵泡液及精液中蛋白種類繁多，不容易從中純化出INH-B，并且收集大量樣品有一定的困難。本實驗擬通過對女性卵泡液中INH-B的分離純化方法及其在卵泡液中分子存在形式的研究，為進一步研究INH-B在臨床診斷中的作用打下一定基礎。

材料與方法

一、研究對象

1.卵泡液樣本：取自北京市家圓醫院正常女性卵泡液，共25例，均為育齡期女性成熟卵泡。所有樣本均經家圓醫院倫理委員會批準，征得志愿者和患者知情同意。

2.主要試劑：兩性電解質（Sigma，美國），考馬斯亮藍R-250（Sigma，美國），牛血清白蛋白（BSA）（Sigma，美國），Inhibin B Gen II ELISA kit（Beckman，美國），聚乙二醇-20 000（PEG-20 000）（西朧化工），乙腈、丙酮、乙醇（北京試劑廠）。

3.主要儀器：聚丙酰胺凝膠電泳儀、電轉儀、Rotofor System（BIO-RAD，美國），凝膠成像掃描分析儀（北京君意東方電泳設備），二乙基氨乙基（DEAE）陰離子交換柱（Pharmacia，美國），紫外分光光度計（Thermo Fisher，美國）。

二、研究方法

1.Bradford法測總蛋白質濃度：將標準BSA 配制成1mg／ml，分別取0、2、4、6、8、10、12、14 和16 μl加入到96孔酶標板中，每個濃度重復2次，并以去離子水補至終體積20μl，再加入280μl Bradford工作液，充分混勻，在570nm 紫外波長處測定OD值，利用Excel軟件計算OD 平均值并繪制出標準曲線。當相關系數R2≥0.98時認為兩者間存在線性關系。將待測樣品1μl加入酶標板中，去離子水補至終體積20μl，加入280μl Bradford工作液，同一樣品重復3次。測OD570nm 值，取3次平均值后根據標準曲線計算樣品蛋白濃度。

2.去除卵泡液中的高豐度蛋白［8］：解凍-20℃保存的卵泡液，4℃12 000r／min 離心15min，分別取上清10 ml，分別與1.2 倍體積的乙腈、丙酮、乙醇混合，立即震蕩混勻5 min，然后3 000r／min 離心15min，取上清，棄沉淀。將上清置于風扇下，揮發至體積10ml。再向各管中加入4倍體積的冷丙酮，-20℃靜置1h，至蛋白沉淀完全，3 000r／min離心15 min，棄上清，留沉淀。室溫放置至丙酮完全揮發，用2ml雙蒸水（ddH2O）溶解沉淀。

3.聚丙烯酰胺凝膠電泳：取樣品20μl，加入上樣緩沖液，沸水浴5 min 使蛋白變性。電泳條件：60V恒壓，樣品至濃縮膠與分離膠界限，約30min，150V 恒壓至溴芬蘭到達凝膠底部，約1h。

4.凝膠染色和脫色：使用新配制的考馬斯亮藍R-250染色，室溫1h。再用新配的脫色液脫色完全，用ddH2O 漂洗，并用ddH2O 浸泡保存。

5.DEAE-Sephadex A-50 柱 層 析 純 化 方 法［9］：DEAE-Sephadex A-50經預處理、裝柱、平衡、上樣、洗脫后收集樣品，再用紫外分光光度計分別測定每管OD280nm 值，并以OD280nm 為縱座標，以試管編號為橫座標，繪制洗脫曲線。合并、濃縮：將洗脫峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進行合并，以PEG-20000洗縮至適當體積，于4℃保存備用。

6.蛋白質等電點分離法（Rotofor System）：取上述純化的樣品20ml，加入2ml兩性電解質混勻，再補水稀釋至50 ml，并全部注入Rotofor System樣品槽中，加水補齊至樣品槽中無氣泡。恒功率12 W（電壓為400～500V，電流20～30mA），啟動后4.5h共收集20樣品。

用pH 計分別測上述收集的20 管樣品的pH值，酸性樣品用0.1 mol／L pH 9.5的Tris-HCl調pH 至中性；堿性樣品用稀釋10倍的HCl調pH 至中性。

7.INH-B蛋白含量測定：按照Inhibin B Gen II ELISA kit的操作說明，完成測定。將待測樣品與酶標孔表面的抗體起反應，用洗滌的方法使酶標孔上形成抗原抗體復合物并與樣品中其他物質分開。再分別加入一抗和酶標記的二抗，通過抗原抗體反應結合在酶標孔上。加入酶反應底物后，生成有色產物，用酶標儀測450nm 吸光值。

8.蛋白樣品的透析：將需要透析的樣品裝入截流分子量為14 000的透析袋中，袋兩端用封口夾封閉后浸沒于透析液（ddH2O 或上樣緩沖液）中，磁力攪拌，每0.5h更換1次透析液，重復3次。

9.蛋白樣品的濃縮：將透析處理后的樣品連同透析袋包埋于PEG-20000中，濃縮樣品至所需體積后回收樣品。

結 果

一、Bradford法繪制BSA 標準曲線

根據標準的OD570值繪制出BSA 標準曲線，求得R2＝0.985，公式為y＝0.0772x＋0.8493。BSA標 準 品 的OD570值 分 別 為：0.849、1.103、1.158、1.313、1.497、1.621、1.776、1.830μg／μl。

圖1 Bradford法繪制BSA 標準曲線

二、3 種去除卵泡液中的高豐度蛋白方法的比較

按標準蛋白曲線回歸方程計算出原樣品的蛋白總量為37mg，經3種方法處理后樣品的蛋白總量分別為22.5mg、17.1mg、32.8mg。結果表明，樣品經丙酮、乙醇、乙腈處理后分別可清除60.9%、46.3%、88.7%的高豐度蛋白，即乙腈法處理卵泡原液去除高豐度蛋白是最優的方法。（圖2）。

三、DEAE-Sephadex A-50柱層析純化蛋白結果

DEAE-Sephadex A-50柱層析純化蛋白共收集39管蛋白，從洗脫曲線可看出，洗脫峰出現在第14管和第15管（圖3）。

圖3 DEAE-Sephadex A-50柱層析純化蛋白洗脫曲線

四、Rotofor System 蛋 白 分 離 及 等 電 點 鑒 定結果

對Rotofor System 所收集的20管樣品處理后用Inhibin B Gen II ELISA kit檢測每管中INH-B的濃度，其中第3 和第4 管INH-B 的濃度分別為590pg／ml和750pg／ml，蛋白質等電點（isoelectric point，pI）分離法測得第3和第4管pI值分別為4.5和4.6。由此可推斷出卵泡液中INH-B 的pI在4.55左右（表1）。

五、目的蛋白INH-B的回收率

采用Inhibn B Gen II ELISA kit試劑盒繪制INH-B濃度測定標準曲線，INH-B標準品的濃度分別為0、10、30、100、250、500、1 000pg／ml，其對應OD450值 依 次 為0、0.051、0.142、0.503、1.192、2.085、3.179。其 中R2＝0.9718，公 式 為y＝298.95x-35.445（圖4）。

以100 ml原始卵泡液為初始樣品，樣品中總INH-B的含量為17.3μg。經乙腈、DEAE-Sephadex A-50柱層析、Rotofor System 蛋白分離3次處理，依次編號為1、2、3，各步樣品中INH-B 的含量分別為10.7、8.9、6.7μg，經過3次純化后回收率為38.70%（表2）。

表1 測量20管樣品INH-B的濃度和pI值

圖4 INH-B濃度測定標準曲線

表2 目的蛋白INH-B的回收率

討 論

女性體內INH-B由卵巢中、小竇卵泡顆粒細胞產生，具有反饋性抑制垂體FSH 分泌和調節生殖細胞發育的重要功能，可直接反映卵巢儲備功能。INH-B的監測在女性生殖及輔助生殖技術中的應用有重要意義［10］。

男性體內INH-B 是直接由睪丸分泌的二聚體糖蛋白激素，對多種外源性激素起反應。血清INH-B水平受年齡、睪丸體積、青春期發生時間、標本采集時間、不同人群等多種因素影響。INH-B 能直接反映睪丸的精子發生，可作為臨床評價男性生育力的重要指標［11-12］。睪丸穿刺活檢是診斷無精子癥的“金標準”，但血液中INH-B水平檢測作為部分替代和補充，可作為睪丸生精障礙的間接診斷依據，但這一依據的準確性依然存在爭議［13-14］。因此，隨著生殖醫學的發展，直接以精液為研究、檢測材料的方法引起人們的興趣。

現有的文獻中，最新的對于血液中INH-B 存在形式的研究已經很完整［15］，而對于男性精液和女性卵泡液中INH-B的存在形式及其理化特性的相關研究基本上是空白。由于受到材料的限制，以往對于INH-B純化方法的研究，多取材于動物，如豬卵泡液［9］等。本實驗則使用人卵泡液為實驗材料，利用INH-B 本身的生化性質，通過乙腈富集、陰離子交換柱分離、等電點分離的“三步分離法”，初步純化獲得人體卵泡液中天然INH-B蛋白分子粗制品，純化回收率達38.70%，并準確鑒定出其在人體中的等電點為4.55左右，為近一步研究人體INH-B的功能和結構特征打下基礎，可能為臨床診斷產品的開發提供了新的思路和理論依據。

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