用于巨型脂質體制備及收集的微流控芯片研究

王振宇等

磷脂酰膽堿（1，2Diacylsnglycero3phosphocholine， PC）、膽固醇（3βHydroxy5cholestene， cholesterol， Chol）購自美國SigmaAldrich公司；乙醚、NaCl、蔗糖、葡萄糖購自中國科龍化工公司；PDMS購自美國Dow Corning公司。聚丙烯基板（2 mm厚）購自中國新濤公司；玻璃片、ITO玻璃、導電膠布購自中國珠海凱為公司。

3 結果與討論

3.1 巨型脂質體制備

脂質膜的情況和電場參數是影響巨型脂質體電形成效果的重要因素。其中，脂質膜的形成由脂質溶液的濃度、體積、腔室的形狀及尺寸等決定；電場參數涉及電場分布、電壓、頻率、施加時間等。在兩種微電

極陣列中分別開展多種參數（脂質溶液濃度、電壓、頻率、施加時間，見表1）的脂質體制備實驗。根據前期研究結果[14]，磷脂酰膽堿（PC）和膽固醇（Chol）濃度比維持在5∶1。

將脂質溶液輸入并充滿兩種微電極陣列所在微通道，真空干燥后，使溶劑完全蒸發形成脂質膜；注入水溶液后，在45 ℃下施加交流電場（正弦信號），觀察巨型脂質體形成情況。

在電形成過程的最初階段，巨型脂質體形成主要受脂質膜影響。電極附近的脂質膜較微通道中間厚，更利于巨型脂質體的形成。當脂質溶液濃度較低時（0.5 mg/mL PC和0.1 mg/mL Chol），僅電極附近的脂質膜厚度足以膨脹形成單層巨型脂質體，但是產量很低。之后，巨型脂質體的電形成產量、比率和速度脂質溶液濃度增加而遞增，但其濃度超出了一個閾值（9 mg/mL PC和1.8 mg/mL Chol）后，所形成巨型脂質體互相疊加為不穩定條狀結構（圖2），巨型球形脂質體產量也不再增加。當PC和Chol濃度分別為6和1.2 mg/mL時，巨型球形脂質體產率較高。

在電形成過程后期，電場分布、幅值、頻率、電場施加時間均對巨型脂質體的形成有影響（圖3）。在電場較強區域，脂質體能更快膨脹形成。兩種不同的微電極陣列中形成的巨型脂質體形狀較相似，但交錯電極陣列上的形成速率更快。此外，當脂質濃度逐漸增大時，在平板電極陣列中脂質體形成于整個通道，到后期邊緣和中間的脂質體的膨脹會逐漸受到阻礙；而交錯電極陣列上的巨型脂質體常形成在電極附近，中間位置的脂質膜就幾乎不膨脹。在電場強的位置，脂質膜的膨脹速度也快于平板電極陣列，所形成巨型脂質體的形態也更好。這表明電場強度的增加有助于脂質體的快速形成。隨著電場幅值的增加，脂質體膨脹形成速度增加，但由此產生的大粒徑球形脂質體（粒徑>50SymbolmA@ m）穩定性減弱、容易損壞，所以最終收集到的巨型脂質體比例在電壓增加后并沒有明顯增加。在微電極陣列中，由于較小的電極間距有助于產生更大的場強，很小的電壓就足以實現巨型脂質體（球形，粒徑≤50SymbolmA@ m）的快速電形成，實驗結果較佳的電壓為0.45 V。

隨著頻率增加，脂質體膨脹和封閉也更快。當頻率達到1000 Hz時，收集到的巨型脂質體較多，而頻率繼續增高時收集量沒有明顯的增加；電場施加時間影響巨型脂質體的膨脹和封閉，在時間遠小于60 min時，巨型脂質體還較少形成，很多巨型脂質體還在膨脹過程中；當時間達到60 min后，多數巨型脂質體基本形成；進一步增加電場施加時間，產量沒有明顯的變化。因此，就本研究所采用的芯片制備裝置，適宜的脂質濃度、電場分布、電壓、頻率、電場施加時間等參數分別為：磷脂酰膽堿和膽固醇濃度為6.0和1.2 mg/mL，交錯電極、0.45 V，1000 Hz、60 min。此時，穩定的巨型球形脂質體的產率可以達到約60%。采用目前常用的ITO玻璃電極+PDMS墊片搭建的電形成腔室進行對照實驗，在相同腔室體積、脂質用量、已報道的實驗參數[15]，巨型球形脂質體的產率僅為32%。

3.2 巨型脂質體收集

制備完成后，向制備腔室中緩慢注入等滲的葡萄糖、NaCl的水溶液（504SymbolmA@ L），可在一定程度上避免巨型脂質體粒徑大、易形變、整體強度較差，在操作時容易破裂等問題。利用液流運動輕柔地將制備腔室里的巨型脂質體等物質輸送到收集腔室。

經重力沉降和微孔濾膜過濾作用，符合要求的巨型脂質體留在收集腔室上層（圖4），尺寸較小的物質則通過濾膜進入腔室下層，經微通道流入廢液腔室。多次重復實驗表明，在收集腔室中可以收集得到90%以上的巨型脂質體（粒徑在10～50）交錯微電極陣列制備的巨型脂質體收集效果優于平板微電極陣列，這也證明交錯微電極陣列可以得到更多，更穩定的巨型脂質體。但仍有少部分尺寸較小的物質由于本身質量太輕，在浮力作用下仍然停留在收集腔室上層。針對這部分物質，今后可在腔室下層增加輕柔抽吸作用加以去除。

4 結 論

本研究采用了微流控芯片收集方法， 獲得了更好的巨型脂質體制備效果， 并盡量多地收集所需的穩定巨型球形脂質體。通過構建兩種不同微電極陣列結構，進行了多種脂質濃度、電壓、頻率、電場施加時間的實驗研究。結果表明，交錯電極對電場的聚焦作用有利于局部高電場區脂質體的膨脹形成，因此更適合巨型脂質體的制備。不同脂質濃度和電場參數對巨型脂質體的電形成有明顯的影響，多參數探索表明，在微電極陣列芯片中選擇磷脂酰膽堿和膽固醇濃度為6.0 mg/mL和1.2 mg/mL，電場參數為電壓0.45 V、頻率1000 Hz、加載時間60 min可以得到很好的制備效果。此時，穩定的巨型球形脂質體的產率可以達到60%，明顯優于常規制備方法。

在制備研究基礎上開展了收集芯片模塊的研究，通過不同組分在收集腔室和廢液腔室間的分選操作，可以在收集腔室中大量獲得巨型脂質體（粒徑在10～50SymbolmA@ m范圍內，大多為球形、較穩定），為巨型脂質體的進一步應用奠定了良好基礎。

References

1 Jesorka A， Orwar O. Ann. Rev. Anal. Chem.， 2008， 1： 801-832

2 Vorselen D， Roos W H， van Loon J J W A， Wuite G J L. Biophys. J.， 2013， 104 （2）： 620A-620A

3 DeNardis N I， Ruzic I， PecarIlic J， El Shawish S， Ziherl P. Bioelectrochem.， 2012， 88： 48-56

4 Guo B H， Cheng Y， Li N Y， Li X F， Jin M Z， Li T， Li J. J. Drug Target， 2013， 21 （3）： 257-264

5 Portet T， Mauroy C， Demery V， Houles T， Escoffre J M， Dean D S， Rols M P. J. Membr. Biol.， 2012， 245 （9）： 555-564

6 Mikelj M， Praper T， Demic R， Hodnik V， Turk T， Anderluh G. Anal. Biochem.， 2013， 435 （2）： 174-180

7 Shimanouchi T， Umakoshi H， Kuboib R. J. Colloid Interface Sci.， 2013， 394： 269-276

8 Natsume Y， Toyota T. Chem. Lett.， 2013， 42 （3）： 295-297

9 Kang Y J， Wostein H S， Majd S. Biophys. J.， 2014， 106 （2）： 632a

10 Tsumoto K， Nomura S M， Nakatani Y， Yoshikawa K. Langmuir， 2001， 17 （23）： 7225-7228

11 Hu P C C， Li S， Malmstadt N. ACS Appl. Mater. Interfaces， 2011， 3 （5）：1434-1440

12 Patil Y P， Jadhav S. Chem. Phys. Lipids， 2014， 177： 8-18

13 Mikelj M， Praper T， Demic R， Hodnik V， Turk T， Anderluh G. Anal. Biochem.， 2013， 435 （2）： 174-180

14 Wang Z Y， Hu N， Yeh L H， Zheng X L， Yang J， Joo S W， Qian S Z. Colloids Surf B Biointerfaces， 2013， 110： 81-87

15 Kuribayashi K， Tresset G， Coquet P， Fujita H， Takeuchi S. Meas. Sci. Technol.， 2006， 17： 3121-3126

y of Education， Key Lab of Visual Damage and Regeneration & Restoration of Chongqing，

Bioengineering College， Chongqing University， Chongqing 400030， China）

3（Department of Electronic Engineering， Chongqing City Management College， Chongqing 400055， China）

Abstract A microfluidic chip with the preparation module and collection module was fabricated， in which microfluidic technology and microelectrode array were used for the preparation of giant vesicles. First， lipid solution was loaded into the microelectrode array through microchannels to form lipid film， then an electric field was subsequently loaded on the microelectrode array and the giant vesicles with a controlled diameter were formed efficiently. The ratio of the formed stable giant spherical vesicles could reach up to 60%. Giant vesicles and other materials were flushed into the upper layer of the collection chamber by microchannel. 90% of the stable giant spherical vesicles with 10-50 μm diameter could be sorted in the upper layer of the collection chamber by using micropore filter and gravity depositing. This microfluidic chip could overcome some defects existing in the current preparation method such as low efficiency， wide distribution of diameters， as well as difficult for screening and collection.