基于分子信標及核酸染料SYBR Green Ⅰ定量檢測土壤中的汞

翟琨等

摘 要 利用分子信標、單鏈核酸（ssDNA）及核酸染料SYBR GreenⅠ，通過同步熒光分析法，建立了一種高靈敏、高選擇性土壤汞（Hg2+）的定量檢測方法。在該體系中，分子信標的熒光基團設計為熒光胺（FAM），分子信標的環設計為與ssDNA互補， 但有4個T堿基錯配的序列。在Hg2+存在時，分子信標的環與ssDNA通過“THg2+T”特異性結合形成雙鏈DNA，分子信標的莖被打開，熒光基團與猝滅基團分開，熒光恢復； 同時，核酸染料SYBR GreenⅠ與雙鏈DNA作用，SYBR GreenⅠ的熒光信號顯著增強。SYBR GreenⅠ與FAM的最大激發波長與最大發射波長都很接近，通過同步熒光分析法檢測時，兩種熒光染料的熒光峰重疊，熒光信號增強，可實現Hg2+的高靈敏檢測。體系的最優檢測條件為：緩沖溶液的pH=8.0，孵育溫度為50℃， 孵育4 min， 緩沖溶液中NaCl的濃度為

1 引 言

汞（Hg）是有毒的重金屬元素，在人體中具有累積效應和神經毒性，嚴重威脅著人類健康[1]。隨著工業化、農業現代化及城市化進程的加快，大量的汞通過礦物開采、施肥及空氣傳播等方式進入農田，而土壤中的汞又通過“土壤植物人”的途徑進入人體，對人類健康產生潛在的威脅[2]。

目前，定量檢測汞的常用方法有原子發射光譜[3]、原子吸收分光光度法[4]、原子熒光[5]、色譜與光譜聯用[6，7]及電感耦合等離子體質譜法[8]等。其中，很多方法需要較昂貴的儀器設備，不適合常規檢測。

核酸染料SYBR GreenⅠ是一種不對稱的菁類核酸染料，它本身的熒光信號很弱，與單鏈DNA幾乎不發生作用，但它與雙鏈DNA有很強的親和性，且與雙鏈DNA結合后，其熒光強度會顯著增加。據報道，當核酸染料SYBR GreenⅠ與雙鏈DNA結合后熒光強度會增加800倍以上，是目前所發現的最靈敏的核酸染料之一[9]。基于特異性的“THg2+T”結構對汞的檢測方法已多有報道。Ono[10]及Wang[11]等分別基于“THg2+T”的特異性結構建立了高靈敏、高特異性的檢測水中汞的方法。此后，各種基于“THg2+T”結構對汞的定量檢測，進一步提高了這類方法的靈敏度、選擇性及設備的便攜性等[12～17]。盡管基于“THg2+T”結構對汞的定量檢測方法較多，但方法的靈敏度并不令人滿意。

本實驗利用T堿基與Hg2+能特異性結合形成穩定“THg2+T”結構的特點，將分子信標的環設計成與單鏈DNA互補且T堿基錯配的序列，熒光基團設計為熒光胺（FAM）當分子信標在Hg2+存在時，與富含T堿基的單鏈DNA通過“THg2+T”結構形成雙鏈，再與核酸染料SYBR GreenⅠ作用，使體系的熒光顯著增強。據此建立了一種高靈敏的Hg2+熒光定量檢測方法，并將其應用于土壤樣品的分析中。

2 實驗部分

土壤樣品為黃棕壤，取自湖北恩施白地坪汞礦附近表土（0～20 cm）。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品制備 將分子信標及單鏈核酸C分別溶解在磷酸鹽緩沖液中，均配制成2×10

Symbolm@@ 7 mol/L的溶液，各取50 μL混合均勻后，再加入50 μL不同濃度的Hg（NO3）2溶液，加緩沖液至總體積為400 μL，50℃孵育4 min，冷卻至室溫，加入100 μL SYBR GreenⅠ工作液并在室溫下反應10 min，然后檢測體系的熒光。在所有的實驗中，除文中標注或說明外，分子信標及單鏈核酸的濃度均為2×1Symbolm@@ 8 mol/L，Hg2+的濃度為4×10Symbolm@@ 8 mol/L。

土壤樣品的消化：稱取1.00 g樣品，置于消解罐中，加入6 mL王水和4 mL 30% H2O2，密封后將消解罐放入微波爐中加熱，升溫程序為140℃保持30 min，160℃保持30 min，180℃保持25 min，樣品消解完全后自然冷至室溫。將樣品消解液轉移至100 mL容量瓶中，用1% HNO3定容，搖勻待測。在土壤樣品中汞的測定及加標回收實驗中，均取50 μL的待測溶液，按樣品制備方法處理后進行測定。

2.2.2 Hg2+的檢測

將制備好的樣品放入比色皿中，用同步熒光分析法對Hg2+進行檢測。同步掃描的波長間隔設置為25 nm，熒光分光光度計的激發及發射狹縫寬度均設置為10 nm。

3 結果與討論

3.1 方法可行性分析

Hg2+的檢測原理如圖1所示。沒有Hg2+時，分子信標的環與ssDNA中有多個TT錯配堿基，不能形成雙鏈結構，核酸染料SYBR GreenⅠ只與分子信標的莖（雙鏈部分）作用，由于分子信標雙鏈很短（只有6個堿基對），其熒光信號較弱； 在有Hg2+時，分子信標與富含T堿基的單鏈核酸通過“THg2+T”特異性結合形成雙鏈DNA，與SYBR GreenⅠ的作用增強，其熒光信號顯著放大； 同時，分子信標的莖環結構被破壞，熒光基團FAM與猝滅基團BHQ1分開，FAM的熒光恢復。SYBR GreenⅠ與FAM的最大激發波長與最大發射波長都很接近，它們的波長間隔（Δλ）也幾乎相等，因此，當Hg2+通過同步熒光分析法進行檢測時，兩種熒光染料的熒光峰重疊，熒光信號顯著增強，因此實現Hg2+的高靈敏檢測。

實驗結果表明，只有分子信標和熒光染料SYBR GreenⅠ時，體系的熒光強度相對較弱（圖2a）； 在此體系中引入單鏈核酸（C），而沒有Hg2+存在時，體系的熒光強度略有增加，但增加幅度很小（圖2b）； 當在上述體系中引入單鏈核酸，而又有Hg2+存在時，體系的熒光強度顯著增加，且Hg2+濃度不同時，其所對應的熒光強度具有明顯的區別（圖2c和圖2d），證明了利用上述原理對Hg2+定量檢測的可行性。a， 分子信標+SYBR GreenⅠ； b， a+單鏈核酸； c， b+2.5×10Symbolm@@ 8 mol/L Hg2+； d， b+5×10Symbolm@@ 8 mol/L Hg2+。a， molecular beacon （MB）+SYBR GreenⅠ； b， a+single stranded DNA （ssDNA）； c， b+2.5×10Symbolm@@ 8 mol/L Hg2+； d， b+5×10Symbolm@@ 8mol/L Hg2+

3.2 Hg2+測定條件的優化

3.2.1 加入SYBR GreenⅠ體積的優化 根據實驗原理，SYBR GreenⅠ在分析體系中應該保持相對過量，但濃度過大又會產生大的背景信號。考察了實驗中加入SYBR GreenⅠ工作液的體積對熒光檢測信號的影響。結果表明，SYBR GreenⅠ工作液的體積在達到60 μL后，其熒光強度不再發生改變。為了保證實驗過程中SYBR GreenⅠ相對過量，本實驗選擇其體積為100 μL。

3.2.2 pH值的影響 實驗以磷酸鹽緩沖液作為緩沖體系，考察pH值對測定結果的影響。結果表明，在pH 6.8～8.0范圍內，體系的熒光強度隨pH值增加而增大，隨著pH值繼續增加，熒光強度略有降低。本研究選擇pH 8.0 的磷酸鹽緩沖體系。

3.2.3 孵育溫度和孵育時間的影響

加熱孵育的目的是為了打開分子信標的莖（雙鏈部分解鏈），從而加快分子信標與單鏈核酸反應的速度。體系在冷卻過程中，分子信標與富含T堿基的單鏈核酸在Hg2+存在時，通過“THg2+T”特異性結合形成雙鏈DNA。孵育時間設為4 min，考察孵育溫度進行了考察。結果表明，反應溫度在30℃～50℃時，體系的熒光強度隨著溫度的升高而增大； 當溫度超過50℃后，體系的熒光強度幾乎不變，說明在50℃時，分子信標的莖可以完全被打開。因此后續實驗選擇孵育溫度為50℃。

孵育溫度設為50℃，考察了孵育時間在2～10 min內的影響。體系的熒光強度隨著時間延長而增加，當孵育時間超過4 min時，熒光強度趨于穩定，分子信標的莖已完全打開，因此孵育時間選擇為4 min。

3.2.4 離子強度的影響 離子強度對雙鏈DNA的形成具有明顯的影響。通過加入不同濃度的NaCl考察離子強度對體系熒光強度的影響，結果表明，NaCl濃度在10～30 mmol/L之間時，體系的熒光強度隨著NaCl濃度的增加而增大，當NaCl濃度超30 mmol/L后，其熒光強度略有下降，這主要是因為高濃度Cl-對熒光染料有猝滅作用[18]。本研究選擇最適NaCl濃度為30 mmol/L。

3.3 最優條件下的工作曲線及檢出限

在最優實驗條件下，即緩沖溶液的pH=8.0，孵育溫度為50℃， 孵育時間為4 min， 緩沖溶液中NaCl的濃度為30 mmol/L，SYBR Green I工作液的體積為100SymbolmA@ L，測定不同濃度Hg2+存在時的體系熒光強度（圖3）。Hg2+濃度在5×10Symbolm@@ 10～4×10

3.4 干擾實驗

對土壤中常見的干擾離子Ca干擾實驗的結果如圖4所示，加入土壤中的干擾離子濃度為Hg2+濃度（4×10

Symbolm@@ 8 mol/L）1000倍時，Hg2+所對應的相對熒光強度仍遠大于其它干擾離子，表明本方法法對土壤中Hg2+的檢測具有很高的選擇性。

3.5 土壤中汞含量的檢測及加標回收實驗

分別取4份相同的土壤樣品，分別加入不同濃度Hg（NO3）2，按前述方法消化后，采用本法檢測各樣品中汞的含量（表1）。結果顯示，本實驗所測土壤樣品中汞的含量為3.10 mg/kg，加標樣品的回收率為97.7%～100.6%。

取2份相同的土壤樣品，按前述方法消化后，分別用本方法和原子熒光法測定汞含量，結果分別為3.11和3.23 mg/kg（n=3）， 兩種方法測定結果基本相同，說明本方法具有較好的準確性。

3.5 土壤中汞含量的檢測及加標回收實驗

分別取4份相同的土壤樣品，分別加入不同濃度Hg（NO3）2，按前述方法消化后，采用本法檢測各樣品中汞的含量（表1）。結果顯示，本實驗所測土壤樣品中汞的含量為3.10 mg/kg，加標樣品的回收率為97.7%～100.6%。

取2份相同的土壤樣品，按前述方法消化后，分別用本方法和原子熒光法測定汞含量，結果分別為3.11和3.23 mg/kg（n=3）， 兩種方法測定結果基本相同，說明本方法具有較好的準確性。

4 結 論

本實驗利用分子信標及含TT錯配的堿基的單鏈核酸，結合核酸染料SYBR GreenⅠ，建立了一種土壤中Hg2+的定量檢測方法。與以前報道的基于“THg2+T”結構測定汞的分析方法相比[10，16，17]，本方法利用核酸染料SYBR GreenⅠ及分子信標的熒光基團所產生的熒光采用同步熒光法對汞進行檢測，方法的靈敏度更高，檢出限更低，而分子信標的引入，使方法的特異性增強，選擇性更高。

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Abstract A highly sensitive and selective fluorescence method for quantitative detection of mercury in soil was developed based on molecular beacon （MB）， singlestranded nucleic acid （ssDNA） and nucleic acid dye SYBR Green I by synchronous fluorescence analysis. In this strategy， the fluorophore of MB was 6carboxyfluorescein group （FAM）， and the loop of MB was complementary to the ssDNA with four TT mismatches. In the presence of Hg2+， the MBs and ssDNA with TT mismatches formed doublestranded DNA （dsDNA） via THg2+T coordination structure， then the fluorophore FAM was separated from the quencher BHQ1， thus emitted fluorescence. Meanwhile， SYBR Green I bound to dsDNA， so the fluorescence intensity of SYBR Green I was significantly enhanced. When subjected to synchronous fluorescence analysis， the fluorescence peaks of FAM and SYBR Green I overlapped completely， so the fluorescence signal of system could be significantly enhanced. Thus， highly sensitive fluorescence quantitative detection for Hg2+could be realized. In this strategy， the optimal conditions for Hg2+ determination were as follows： buffer solution pH of 8.0， incubation temperature of 50℃， incubation time of 4 min， 30 mmol/L NaCl in buffer solution and the volume of SYBR Green I of 100 μL. Under the optimum conditions， the total fluorescence intensity of SYBR GreenⅠ and FAM exhibited a good linear dependence on quantity of Hg2+ in the range of 5.0×10

Symbolm@@ 10-400×10

Symbolm@@ 8 mol/L. The regression equation was ΔI=1.3949C+19.3596 with a correlation coefficient of 0.9976 （R2）， where ΔI was the total fluorescence intensity difference in the presence and absence of Hg2+. The detection limit was 3×10

Symbolm@@ 10 mol/L （3σ， n=11）. The proposed method exhibited good precision， high selection， simple operation， fast detection speed， low detection limit and high sensitivity. This method was applied to detect mercury ion in soil and a satisfactory recovery of 97.7%-100.6% was obtained. The detection result was consistent with that by atomic fluorescence spectrometric method.