新型纖維素鄰乙酰水楊酸酯類手性固定相的合成及評價

李楊等

摘 要 以纖維素和鄰乙酰水楊酰氯為原料， 合成了纖維素鄰乙酰水楊酸酯類手性固定相， 考察了其手性拆分能力， 與Chiralcel OJ手性色譜柱進行了比較， 并研究了流動相的組成以及衍生物中雙酯羰基的結構對其拆分效果的影響。以紅外光譜技術、熱重分析等檢測手段對獲得的纖維素衍生物進行結構表征和分析。在對4種流動相： 正己烷異丙醇、正己烷乙醇、正己烷甲醇異丙醇、正己烷甲醇1，2二氯乙烷進行比較篩選后， 以正己烷異丙醇（90∶10～80∶20， V/V， 0.1% DEA或TFA）體系作流動相， 在正相色譜模式下， 對兒茶酚胺類及酰胺類手性藥物進行了手性拆分， 結果表明， 三氟乙酸和二乙胺的最佳使用量均為0.1%， 雙酯羰基結構的氫鍵、偶極作用和苯環的ππ作用相互協同確實有助于該類固定相手性拆分作用的形成。

關鍵詞 ；鄰乙酰水楊酸酯； 纖維素； 手性固定相

1 引 言

手性制藥一直是醫藥研究的前沿領域[1]， 這是因為消旋體作為藥物使用具有一定的風險， 兩個對映體通常表現出不同的藥效活性， 甚至其中之一還有毒性[2]。因此， 發展高效、快捷的手性藥物拆分測定方法對用藥安全具有重要的意義[3，4]。

據統計， 有近90%的手性樣品可以在纖維素衍生物作為手性固定相上獲得拆分[5～7]。Okamoto研究小組[8，9]曾證明纖維素三苯酯中苯基上取代基的類型和位置對纖維素衍生物的光學拆分能力有顯著的影響——纖維素衍生物苯環上的取代基通過吸電子或斥電子作用減少或增加苯環和羰基氧上的電子云密度， 進而影響手性識別能力。 目前， 此類苯環取代基大都是簡單的烴基或鹵原子， 選擇范圍較窄， 而纖維素作為多羥基化合物， 凡是具有能與羥基鍵合的官能團的化合物均能對其修飾。受此啟發并根據手性拆分的機理， 本研究組認為乙酰水楊酰氯是一種很有潛力的手性拆分用纖維素衍生化試劑， 其鄰位的酯基既能提供一個羰基， 又對苯環起到活化并給電子的作用， 如與纖維素成酯， 將同時出現兩個活潑酯羰基， 這對于手性拆分是十分有利的。而且目前該類纖維素衍生物無論在纖維素研究中， 還是手性拆分領域均未有見報道。本實驗合成了鄰乙酰水楊酸酯類手性固定相（Acelylsalicylte chiral stationary phase， ACSP）， 針對常用的氯苯那敏、兒茶酚胺類及酰胺類藥物進行手性拆分， 根據拆分結果探討其規律與特點， 并與商品柱進行比較， 研究其優勢或不足， 為纖維素類手性固定相的種類擴展提供新的思路。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Nicolet370FTIR紅外光譜儀（美國Thermo公司）； TGA熱重分析儀（Q500系統， 美國Waters公司）； LC30A高效液相色譜工作站（日本島津公司）， 配置SPDM20A二極管陣列檢測器； 商品柱Chiralcel OJ（由河南省食品藥品檢驗所提供）。

微晶纖維素（聚合度DP≈100， Merck公司）； 鄰乙酰水楊酰氯、γ氨丙基三乙氧基硅烷（KH550， 上海阿拉丁試劑公司）； 硅膠（粒徑為5 μm， 孔徑為120 ， 日本Daiso公司）； 無水N，N二甲基乙酰胺（DMAc）、氯化鋰、無水吡啶（分析純， 天津市科密歐化學試劑有限公司）； 甲醇、乙醇、1，2二氯乙烷、異丙醇和正己烷

2.2 酯化衍生纖維素的合成

將在80℃真空干燥6 h的纖維素1 g加入70 mL無水DMAc中， 130℃攪拌回流5 h； 冷至室溫， 加入3 g 無水LiCl； 攪拌至纖維素完全溶解后[10]， 重新升溫至100℃， 加入無水吡啶15 mL、7.4 g 鄰乙酰水楊酰氯， 反應24 h后， 用大量甲醇沉淀、洗滌、過濾， 40℃真空干燥過夜后， 得纖維素衍生物5.6 g（見圖2）。

2.3 氨丙基硅膠的制備

將3 g硅膠與160 mL無水甲苯加入燒瓶中， 氮氣保護下加熱回流， 除去吸附水。緩緩加入5 mL KH550與1 mL吡啶， 并加熱至105℃， 回流。反應完后抽濾， 洗滌， 減壓干燥后得氨丙基硅膠[11]。經熱重分析， 鍵合量為7.7%（w/w）。

2.4 HPLC手性固定相的制備

稱取1 g纖維素衍生物，溶于40 mL四氫呋喃中， 分次涂敷在3 g氨丙基硅膠表面，并旋轉蒸發除去四氫呋喃[12]， 如此反復多次后即得ACSP。經熱重分析， 涂敷量約為25.1%（w/w）。

2.5 色譜條件

色譜柱（15 cm×0.46 cm i.d.）。以正己烷異丙醇（80∶20， V/V）為勻漿液及填充液， 采用勻漿法裝柱。檢測條件： 柱溫30℃； 檢測波長段： 190～400 nm（附圖均為各手性藥物的最大吸收波長處的色譜圖， 無最大吸收者， 以220 nm波長處色譜峰為主）； 以正己烷醇為流動相（可添加少量二乙胺（DEA）或三氟乙酸（TFA））。流速為1 mL/min， 以1，3，5三叔丁基苯測定死時間t0， 均以流動相溶解手性化合物， 濃度約為80 μg/mL， 進樣量： 20 μL。

固定相的拆分能力測試與考察

對7種手性藥物進行拆分評價， 并以下列參數對OJ柱、ACSP進行考察： 保留因子k=（t-t0）/t0， 其中t0為死時間， 由1，3，5三叔丁基苯來測定； t為對映單體的保留時間； 分離因子α=k2/k1； 分離度Rs與理論板數n均由色譜軟件自動計算。

3.2.1 與OJ柱的比較及拆分機理 經過色譜條件的優化后， OJ柱、ACSP的最佳拆分條件及結果見表1和圖4。表1中， 對于消旋體1、2、3及4， OJ柱分離度明顯弱于ACSP， 保留時間也更長， 因此拆分效果不及ACSP。其中兒茶酚胺類消旋體2、3及4的手性中心均與羥基和苯環相連接， ACSP分離度優于OJ柱的原因可能是ACSP中苯環上的雙酯基與消旋體2、3及4的手性中心上的羥基發生的氫鍵作用強于OJ柱上的單酯基。

消旋體2的苯環上有一鄰位氯， 對苯環吸電子， 消旋體3的苯環上有兩個間位羥基， 對苯環供電子， 而ACSP中的鄰位酯基也對苯環供電子， 因此， 消旋體2與ACSP發生的ππ作用強于藥物3與ACSP， 從而導致在ACSP的拆分中， 消旋體2的保留時間長于消旋體3， 分離效果也優于消旋體3。消旋體3與4的側鏈氨基取代基不同： 消旋體3中為叔丁基， 4中為異丙基。在ACSP上， 消旋體3的保留時間短于4， 但分離效果卻優于4， 二者苯環產生ππ作用的能力相近， 應是叔丁基產生的分子位阻大于異丙基， 阻擋了一部分非手性作用力對手性藥物的吸附， 因此造成消旋體3的保留時間短， 分離效果好。

消旋體5、6及7為酰胺類化合物， 該類化合物利用其手性中心上酰胺的氫鍵作用， 能夠在刷型固定相上得到有效拆分[13]以及在氨基甲酸酯類纖維素衍生物固定相上得到部分拆分[14]， 但在OJ柱上未見拆分跡象， 分析應與OJ固定相上產生氫鍵作用的官能團較少有關。然而， 消旋體5、6及7卻能在ACSP上得到有效分離， 這應歸因于三者的酰胺基與水楊酸酯鄰位的酯羰基產生的氫鍵作用和偶極作用。在三者中， 藥物5的保留時間最短， 分離效果也最佳： 這是因為其只有一個遠離手性中心的苯環（消旋體6和7均有兩個）， 產生非手性ππ作用力， COOH的電離被三氟乙酸所抑制從而減少了離子作用力， 且分子位阻最小， 能夠與ACSP上的手性位點充分接觸， 因此能夠達到最佳效果。消旋體6中醚取代基產生的分子位阻顯然大于7中的羥基， 其分子位阻減少了一些苯環非手性作用力的產生， 因而消旋體6的保留時間短于7， 但由于手性拆分作用力相當， 因此分離因子相差不大。

3.2.2 流動相種類與改性劑對拆分的影響 考察了甲醇、乙醇、1，2二氯乙烷（可少量短時間使用）以及二乙胺、三氟乙酸對固定相拆分能力的影響。選取4號與5號消旋體作為代表， 結果見圖5和表2。

由表2可知， 乙醇替換異丙醇后， 洗脫能力得到提高， 但區分能力不及后者。對于消旋體5， 甲醇比例在10%以內時， 隨著甲醇用量的提高， 保留時間縮短， 并保證良好的分離效果， 說明甲醇比異丙醇在此固定相上有更佳的洗脫能力與區分能力， 但含量應控制其一定范圍內； 而對于保留弱的消旋體4號， 加入甲醇后， 出峰更快， 與固定相的手性作用極不充分， 造成分離不徹底（圖5）。二氯乙烷與甲

醇配合使用能夠達到極性中和的目的。 從表2可見， 此混合溶劑的洗脫能力對于兩類手性藥物均弱于異丙醇， 且區分力也不及后者： 消旋體4號只能部分拆分， 且峰形變寬； 消旋體5號未見拆分跡象。分析應是纖維素衍生物已被二氯乙烷部分破壞導致的。綜上所述， 4種體系中唯有正己烷異丙醇系統能夠對兩類消旋體都達到滿意的拆分效果， 因此， 本研究以正己烷異丙醇作為流動相。

消旋體5號較特殊， 其不僅具有酰胺結構， 還存在羧基。因此， 考察了流動相正己烷異丙醇（80∶20， V/V）中二乙胺（DEA）和三氟乙酸（TFA）的存在比例對手性拆分的影響， 結果見圖6和表3。

由表3可知， 不添加TFA， 消旋體5在45 min內無法洗脫， 這應是羧酸電離后產生的離子作用力導致的；加入0.1% TFA抑制羧酸電離后，即可得到滿意的拆分效果。在0.1% TFA存在的情況下， 隨著DEA濃度增加， 洗脫時間縮短， 而分離效果基本不變， 但DEA增加至0.3%后， 基線波動較大。羧酸電離的抑制作用直接關系到拆分結果， 加入TFA起關鍵作用， DEA的存在只起到縮短洗脫時間的作用， 因此， 本研究采用0.1% TFA0.1% DEA為添加劑濃度。4 結 論

本實驗通過合成酯取代纖維素衍生物， 將纖維素鄰乙酰水楊酸酯用于手性拆分， 取得了良好的拆分效果。初步證明了該纖維素衍生物利用鄰位酯羰基的偶極作用和氫鍵作用配合苯環的ππ作用， 在拆分兒茶酚胺類和手性中心連有酰胺基團的藥物方面， 比OJ柱更有優勢。充分證明了此衍生物上雙酯羰基的強大的手性拆分能力。通過比較流動相發現， 溶劑的種類與相互組合在此手性固定相上表現出的手性區分力差別明顯。此外， 根據手性藥物酸堿性的差別， 合理添加二乙胺或三氟乙酸等流動相改性劑， 能夠達到縮短保留時間、增強拆分效果的作用。

References

1 Ikai T， Okamoto Y. Chem. Rev.， 2009， 109（11）： 6077-6101

2 Ates H， Mangelings D， Heyden Y V. J. Chromatogr. B， 2008， 875（1）： 57-64

3 ZHOU RenDan， LI LaiSheng， CHENG BiaoPing， NIE GuiZhen， ZHANG HongFu. Chinese J. Anal.Chem.， 2014， 42（7）： 1002-1009

周仁丹， 李來生，程彪平，聶桂珍，張宏福. 分析化學， 2014， 42（7）： 1002-1009

4 YAO Na， SONG RuiJuan， FU Yu， SHI HongYu，LONG YuanDe， HUANG TianBao. Chem. J. Chinese Universities， 2008， 29（6）： 1102-1106

姚 娜， 宋瑞娟， 富 玉， 石宏宇， 龍遠德， 黃天寶. 高等學校化學學報， 2008， 29（6）： 1102-1106

5 Tang S W， Li X F， Wang F， Liu G H， Li Y L， Pan F Y. Chirality， 2012， 24（1）： 167-173

6 YANG LiPing， WANG LiXin， XU YanLi， QIAN BaoYing， GAO RuYu. Journal of Instrumental Analysis， 2004， 21（5）： 25-28

楊麗萍， 王立新， 徐艷麗， 錢寶英， 高如瑜. 分析測試學報，2004， 21（5）： 25-28

7 Yamamoto C， Okamoto Y. Bull. Chem. Soc. Jpn， 2004， 77（2）： 227-257

8 Okamoto Y， Kauashima M， Hatada K. J. Chromatog.， 1986， 363（4）： 173-186

9 Okamoto Y， Aburatni R， Hatada K. J. Chromatogr.， 1987， 389（1）： 95-102

10 Kesavan D， Masakazu H， Jun A， Kousaku O. Cellulose， 2013， 20（1）： 365-378

11 Huang J， Chen H， Li T. J. Chromatogr. A， 2006， 1113（12）： 109-115

12 QU HaiTao， LI JunQing， SHEN Jun， SHEN XianDe， Yoshio Okamoto. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（4）： 461-465

屈海濤， 李峻青， 沈 軍， 沈賢德， 岡本佳男. 分析化學， 2011， 39（4）： 461-465

13 LIANG YanMing. Chiral Sepration of Selected Pharmacenticals on rushType Chiral Stationary Phase. Chengdu： Sichuan University， 2003： 36-38

梁彥明. 刷型手性固定相對于藥物對映體的拆分研究. 碩士論文. 四川大學， 成都， 2003， 36-38

14 ZHOU Lan， LI GaoLan， YANG GuoSheng. Journal of Shandong University of Science and Technology（Natural Science）， 2000， 19（3）： 22-24

周 嵐， 李高蘭， 楊國生. 山東科技大學學報（自然科學版）， 2000， 19（3）： 22-24

Abstract Cellulose acetylsalicylate chiral stationary phase was synthesized by using cellulose and Oacetylsalicylryl chloride， and evaluated by HPLC. In this work， Chiralcel OJ was also evaluated for comparison. The effects of mobile phase composition and double ester carbonyls of derivative on enantioseparation were investigated. The structure of the obtained derivative was characterized by infrared spectroscopy and thermogravimetric analysis. Hexaneisopropanol （90∶10-80∶20， 0.1% DEA or TFA） was selected by comparison of four mobile phases： namely hexaneisopropanol， hexaneethanol， hexanemethanolisopropanol and hexanemethanoldichloroethane. Seven racemates of catecholamine and amide were used to evaluate its chiral recognition ability in normal phase elution mode and the regularity and characteristics of the novel chiral stationary phase were explored. Based on the chromatographic results， cellulose acetylsalicylate exhibited high enantioseparation ability for catecholamines and some racemates with amide group due to the carbonyls of acetylsalicylate and the optimum amount of DEA or TFA is 0.1%.

Keywords Acetylsalicylate； Cellulose； Chiral stationary phase

（Received 23 January 2015； accepted 23 April 2015）