gp100:209-217(210M)疫苗的研究進展①

周 帆 朱頤申 鄒巧根 韋 萍 (南京工業大學生物與制藥工程學院，南京 210009)

黑色素瘤是惡性程度最高的皮膚腫瘤，具有高復發率和高死亡率的特點［1］，其5 年生存率低于10%，屬于最難有效治療的腫瘤之一［2］。由于黑色素瘤易發生轉移，主要治療方法為及早局部手術切除根治、晚期化療和放療等，但結果均不理想。近年來，隨著分子生物學及基因工程技術的發展，利用多肽疫苗治療黑色素瘤的方法受到廣泛關注［3-6］。多肽疫苗通過啟動人體自身的免疫功能對抗腫瘤細胞，不會破壞人體其他健康的生理組織，安全性高。gp100:209-217 (210 甲 硫 氨 酸，210Methionine，210M)是一種臨床開發中的治療性合成多肽疫苗，在針對黑色素瘤的臨床試驗中顯示出積極功效，本文現對該疫苗綜述如下。

1 gp100:209-217(210M)疫苗的免疫機制

多肽疫苗是按照病原體抗原基因中已知或預測某段抗原表位的氨基酸序列，通過體外化學合成技術制備而得的多肽片段。與傳統疫苗相比，多肽疫苗可以避免因疫苗毒力回升或滅活不全引起的安全問題，同時可以通過化學合成法高效大量制備。

gp100:209-217 是黑色素細胞蛋白第209 至217 位的多肽片段。黑色素瘤患者接種該多肽疫苗后，能夠刺激并調節人體內白細胞抗原A2(Human leukocyte antigen A2，HLA-A2)限制性細胞毒素CD8+T 淋巴細胞的產生;T 淋巴細胞能夠特異性識別表面帶有gp100 蛋白抗原的黑色素瘤細胞，并分泌能穿透黑色素瘤細胞的酶，溶解gp100:209-217多肽針對的靶向細胞及黑色素瘤細胞株，使黑色素瘤細胞凋亡［7］。gp100:209-217(210M)，也稱為g209-2M，是將gp100:209-217 位點210 處的蘇氨酸置換為甲硫氨酸而制備得到的一種的治療黑色素瘤的多肽疫苗［8］。與 gp100:209-217疫苗相比，gp100:209-217(210M)疫苗提高了與HLA-A2 的結合力，對T 淋巴細胞的免疫應答特異性及組織相容性復合物(Major histocompatibility complex，MHC)分子的親和力更強，對黑色素瘤患者的外周血單個核細胞體外的致敏性(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)效果更好，對惡性黑色素瘤細胞具有更強的免疫活性［9，10］。

2 gp100:209-217(210M)疫苗治療惡性黑色素瘤的研究現狀

2.1 體外試驗 體外致敏性實驗中，將gp100:209-217(210M)疫苗與黑色素瘤患者的PBMCs 直接接觸，以酶聯免疫吸附法(Enzyme linked immuno-sorbent assay，ELISA)測定PBMCs 釋放γ-干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)的生成量，以此作為評價疫苗免疫治療黑色素瘤的性能指標(IFN-γ 主要由活化的T淋巴細胞分泌而來，輔助T 淋巴細胞識別腫瘤)。結果表明，未經疫苗免疫的PBMCs，不產生特異性活性;經gp100:209-217(210M)疫苗免疫的PBMCs，產生了針對HLA-A2+黑色素瘤的特異性活性，且具有高度的特異性［11］。

Liu 等［12］研究了gp100:209-217(210M)疫苗對體外誘導黑色素瘤患者PBMCs 中T 淋巴細胞增殖和表型的影響，聯合使用疫苗和佐劑白介素-2(Interleukin-2，IL-2)、白介素-7(IL-7)、白介素-15(IL-15)與黑色素瘤患者體中的PBMCs 接觸。結果表明:疫苗與IL-7 聯用不能顯著誘導T 淋巴細胞的增殖、表型;疫苗與IL-2、IL-5 均可顯著促進T 淋巴細胞的增殖和表型;聯合使用IL-2、IL-5 和IL-7，其對T 淋巴細胞增殖和表型的刺激與單獨使用IL-2 類似，從而說明聯合使用gp100:209-217(210M)疫苗與IL-2，可有效提高對黑色素瘤的抗原能力，使黑色素瘤退化［13，14］。

2.2 動物試驗 鑒于小鼠gp100:209-217 表位序列(ITDQVPFSV)與人類gp100:209-217 表位序列完全相同，Irvine 等［15］以HLA-A0201/H-2 Kb(A2/Kb)轉基因小鼠為模型，將編碼gp100:209-217(210M)的重組病毒感染機體，研究了其誘導反自CD8+T淋巴細胞對抑制腫瘤抗原gp100 活性的影響。結果表明:經210 位Met 錨定修飾后的免疫原促進了反自CD8+T 淋巴細胞與腫瘤靶細胞的脈沖結合活性，該反自CD8+T 淋巴細胞與野生型gp100:209-217 具有特異性，能夠特異性識別小鼠黑色素瘤A2/Kb 表面的天然抗原表位(B16)，從而提高了重組病毒免疫原的抗原能力。

Tine 等［16］以HLA-A2.1 轉基因HHD 小鼠為模型，研究了gp100:209-217(210M)疫苗對誘導細胞毒性T 淋巴細胞(Cytotoxic T lymphoclyte，CTL)的影響。CTL 是細胞在機體介導免疫的主要效應細胞之一，主要是產生對靶細胞的細胞毒效應，也分泌細胞因子參與免疫調節作用。結果表明:gp100:209-217(210M)疫苗在小鼠體內誘導產生了強烈的CTLs反應。

2.3 臨床試驗 Ⅰ期臨床試驗16 位惡性黑色素瘤患者(9 位男性，7 位女性，平均年齡49 歲)靜脈注射gp100:209-217(210M)疫苗治療黑色素瘤。患者每隔2 周注射一次疫苗，且劑量逐步上升。以毒性、臨床和免疫反應率為首要指標，結果僅2 位患者出現了短暫的毒性反應，表明該多肽疫苗免疫治療毒性反應低。隨機分配10 位患者接受一周期治療，6位患者接受兩周期治療。ELISA 分析結果顯示:5位患者出現了針對gp100 的臨床反應，其中4 位患者的臨床情況穩定或出現腫瘤消退，從而表明該疫苗在黑色素瘤臨床治療方面發揮了積極作用［17］。

Powell 等［18］對5 位惡性黑色素瘤患者接種gp100:209-217(210M)，免疫佐劑為Montanide ISA 51。體外縱向PBMCs 分析顯示多肽特異性CD8+T細胞產生了從早期效應到效應記憶性表型的轉變。一年治療期后，患者體內循環系統中的gp100:209-217(210M)特異性CD8+T 細胞從4.8% 上升至38.1%，并伴隨出現了記憶性T 淋巴細胞，從而說明了注射gp100:209-217(210M)多肽疫苗對黑色素瘤具有免疫效應。

Tarhini 等［19］研究了聯合使用gp100:209-217(210M)、MART-1:26-35 (27L)、酪氨酸酶:368-376(370D)以及佐劑PF-3512676 和GM-CSF 在治療惡性黑色素瘤的安全性和免疫原性。結果表明:其安全性和免疫原性都較好。Ⅱ期臨床試驗［11］31 例轉移性黑色素瘤患者服用高劑量IL-2 后，接種gp100:209-217(210M)疫苗及Montanide ISA-51(不完全弗氏佐劑)，其中13 例出現了臨床反應(42%)，反應率顯著高于單獨使用IL-2 的反應率(15%～20%)［20］，為疫苗與IL-2 聯用治療黑色素瘤提供了依據［21-23］。

Schwartzentruber 等［24］對185 名患者進行了隨機Ⅲ期臨床試驗。參與者為Ⅳ期或局灶晚期黑色素瘤、表達HLA-A 0201、無腦部轉移、適合高劑量IL-2治療的患者。患者被隨機分為IL-2 單藥治療組(每劑量為720 000 U/kg)和聯合治療組，聯合組用藥方法為gp100:209-217(210M)加上每周期不完全弗氏佐劑(Montanide ISA-51)，然后使用IL-2。首要指標為臨床反應率，次要指標包括毒性反應和無進展生存期。結果表明:聯合治療組的總體反應率比單藥治療組高(分別為16、6%，P=0.03)，無進展生存期較長(分別為2.2、1.6 月，P=0.008)，且平均總生存期也較長(分別為17.8、11.1 月，P=0.06)。因此，對于惡性黑色素瘤患者而言，使用疫苗和IL-2聯合治療比單獨使用IL-2 治療有更高的反應率和更長的無進展生存期。

3 提高gp100:209-217(210M)疫苗免疫活性的途徑

腫瘤抗原往往不是單一表達，而是相關抗原的共同表達［25-27］。通常單一多肽抗原表位僅對一部分患者有效，原因在于人類中存在一些被通用MHCⅠ等位基因限制的多肽抗原表位(如HLA-A2，大約存在于40%的人類中)。為了保證疫苗在患者體中廣泛發揮作用，其他CTL 抗原表位也必須被識別。因此聯合采用2 種或多種抗原多肽可有效提高多肽疫苗對腫瘤細胞的殺傷力及其抗腫瘤逃逸的效應。

Levy 等［28］根據多表位多肽疫苗免疫治療黑色素瘤(Multiepitope polypeptide for melanoma，MEPmel)的策略，設計了包含三個重復單元的四抗原表位［gp100:209-217(210M);gp100:280-288(288 纈氨酸，288valine，288V);Mart1:26-35(27 亮氨酸，27leucine，27L);酪氨酸酶:368-376(370 天冬氨酸，370aspartic acid，370D)］。多種多肽通過包含蛋白酶識別的基因序列相互關聯，提高了蛋白解離和抗原表達的能力。結果表明:當用MEP-mel-轉染的樹突狀細胞(DC)刺激多肽特異性T 淋巴細胞，會表達生成細胞因子IFN-γ。同時經MEP-mel-轉染的DC表達的多肽具有蛋白酶依賴性，且比外源釋放原生多肽的表達更持久。DC 負載MEP-mel 蛋白誘導弱交叉表達。因此，多表位多肽疫苗是提高gp100:209-217(210M)免疫療法的策略之一，同時多種抗原多肽的聯合使用擴大了其免疫原性，可應用于其他類型腫瘤的治療［29，30］。

4 展望

綜上所述，gp100:209-217(210M)多肽疫苗能夠特異性主動免疫治療黑色素瘤，其臨床研究已取得一定進展。與其他類型的疫苗相比，gp100:209-217(210M)多肽疫苗因其合成簡單、化學性質穩定、無毒力回升、無致癌性等優點，應用前景更為廣泛［31］。隨著對gp100:207-219(210M)多肽疫苗的進一步深入研究，不斷優化多肽疫苗的設計方法，通過加強腫瘤微環境的免疫能力控制黑色素瘤細胞，如聯合使用不同靶點的抗原多肽、結合適當載體、配伍新型佐劑、利用DC 負載多肽疫苗等方法，進一步改善其免疫原性，最大限度激發疫苗在抗腫瘤的免疫反應。

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