逐級鹽析法結合雙水相萃取純化葛仙米藻藍蛋白

田盼盼，程 超，2，汪興平，2，*

（1.湖北民族學院生物科學與技術學院，湖北 恩施　445000；2.湖北民族學院 生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施　445000）

逐級鹽析法結合雙水相萃取純化葛仙米藻藍蛋白

田盼盼1，程 超1，2，汪興平1，2，*

（1.湖北民族學院生物科學與技術學院，湖北 恩施445000；2.湖北民族學院 生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施445000）

利用逐級鹽析法結合雙水相萃取對葛仙米藻藍蛋白進行純化，設計三因素二次回歸正交旋轉組合試驗對提取工藝進行優化，并應用Design-Expert 7.0軟件建立了各影響因素與萃取純度的數學回歸模型。結果顯示最佳的提取工藝為：20% （NH4）2SO4鹽析去沉淀后用40%和50% （NH4）2SO4鹽析得藻藍蛋白，再用質量分數10%的聚乙二醇6 000、質量分數18%的（NH4）2SO4進行雙水相萃取。所得產物純度可達到8.6，回收率為71.40%。對所得產物進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，得到清晰的兩條條帶（條帶1和條帶2），其分子質量分別在35 ku和15 ku左右。通過質譜分析可知，條帶2的分子質量為15 ku左右，等電點5.35，部分肽的氨基酸序列為TPLTEAVAAADSQGR和DIGYYLR。通過SWISS-MODEL網站模擬蛋白質結構得出，條帶2可能是葛仙米藻藍蛋白的α亞基。

葛仙米；藻藍蛋白；逐級鹽析；雙水相萃?。皇榛蛩徕c-聚丙烯酰胺凝膠電泳；質譜分析

SDS-PAGE electrophoresis； mass spectrometry

葛仙米（Nostoc spharoids Kützing），屬藍藻門（Cyanophyta）藍藻綱（Cyanophyceae）念珠藻科（Nostocaceae）念珠藻屬（Nostoc），又名水木耳，古名天仙菜、天仙米［1］，是一種珍貴的食用藻類資源，同時具有藥用價值。據《本草綱目拾遺》、《本草綱目》記載，葛仙米不僅對燙傷、脫肛、夜盲癥等病癥有療效，還具美容功效［2］。藻膽蛋白是藍藻和紅藻特有的捕光色素蛋白，是一種具有重要生理活性的天然色素。常用于食品、染料、化妝品和醫療保健等方面。其熒光性還可用于生物工程、免疫化學和臨床醫學等領域［3］。此外，它還是一種極具開發潛力的光敏劑，在光合作用的理論研究方面具有重要價值，并可用于腫瘤治療［4］。葛仙米中藻膽蛋白含量豐富，隨著研究的不斷深入，其商業價值日益凸顯，藻膽蛋白的開發和最大限度的利用已備受關注。已知的藻膽蛋白包括藻紅藍蛋白、異藻藍蛋白、藻藍蛋白和藻紅蛋白［5］。目前，通過轉基因方法生產藻膽蛋白的技術尚不成熟，因此獲取該物質的主要途徑還停留在直接從藻類植物中提取的階段［6］。對葛仙米藻膽蛋白的提取、分離與純化工作已取得一定程度的進展。汪興平等［7］用反復凍融法對葛仙米進行細胞壁破除，將葛仙米在0 ℃條件下放置0.5 h后研磨，重復3 次后提取，其細胞壁破除效果良好，蛋白質得率高。采用正交旋轉組合實驗對藻膽蛋白提取工藝進行優化，確定了最佳提取條件為含0.21 mol/L NaCl的pH 7.3的磷酸鹽緩沖液，浸提4.5 h，得率為7.125%［8］。

雙水相萃?。╝queous two-phase extration，ATPE）技術始于20世紀60年代，由Albertsson最早發現。因其具有容易操作、適于放大生產且能充分保證成分的生物活性等優點而被廣泛應用［9］。國內外關于雙水相萃取的報道很多，不少學者通過雙水相萃取出了純度較高的蛋白質。如甘林火［10］、劉清新［11］、劉楊［12］、王巍杰［13］等都做了雙水相萃取技術純化蛋白質的研究。對于雙水相萃取中各種條件的確定也有不少的研究，有研究指出降低上下相體積比可以使目標蛋白純度和產量提高［14］。Pati等［15］發現逐漸提高結線長度，可在結線長度為33.53%時，提高蛋白總產量，最大產量可達97.47%。且結線長度的持續增加會導致界面中的蛋白質不斷沉淀，使藻膽蛋白產量下降。Benavides等［16］研究發現，用低相對分子質量（1 000和1 450）的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）對B-藻紅蛋白分離效果較好。本研究結合鹽析的方法對葛仙米藻藍蛋白進行雙水相萃取，旨在為葛仙米藻藍蛋白的純化提供一定的理論依據和技術基礎。并對純化后的產物進行電泳分析和質譜分析，意在為后續的深入研究提供一定的參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

葛仙米鶴峰縣走馬鎮鶴峰縣葛仙米開發公司。

PEG、（NH4）2SO4、磷酸二氫鉀、三水合磷酸氫二鉀、氯化鈉、甘氨酸、考馬斯亮藍G250、溴酚藍國藥集團化學試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）Biosharp生物科技公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）美國Amresco公司；過硫酸銨中國醫藥上?；瘜W試劑公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺北京拜爾迪生物技術有限公司；fermentas蛋白標準品上海澤邁生物技術有限公司。

1.2儀器與設備

RT-02A型2兩裝粉碎機榮聰精密科技有限公司；SHY-2A數顯水浴恒溫振蕩器金壇市科興器廠；ALPHA1-4型真空冷凍干燥機德國Christ公司；Avanti J-30I冷凍高速離心機美國Beckman公司；WFJ7200紫外-可見光分光光度計尤尼柯（上海）儀器有限公司；FA 2140電子天平上海天平儀器公司；透析袋（3 500）Biosharp生物科技公司；Infinite 200PRO多功能酶標儀瑞士Tecan公司；TDL-60B飛鴿牌低速臺式離心機上海右一儀器有限公司；IKA旋渦混勻器北京中科星宇商貿有限公司；DYCZ-24D型電泳槽、DYY型三恒電泳儀北京市六一儀器廠；STS-2型脫色搖床上海琪特分析儀器有限公司；GENEX單道可調移液槍芬蘭百得實驗室儀器（中國）有限公司。

1.3方法

1.3.1葛仙米藻膽蛋白粗提液的制備

稱取100 g干燥的葛仙米，粉碎，蒸餾水4 ℃充分溶脹，反復凍融3 次使細胞壁充分破除，用pH 7.3的0.5 mol/L磷酸緩沖液（含0.2 mol/L NaCl）浸提4.3 h，4℃、10 000 r/min離心20 min得藻膽蛋白粗提液。

1.3.2逐級鹽析法制取葛仙米藻膽蛋白

在1.3.1節所得粗提液中加入一定質量的（NH4）2SO4，使溶液質量分數達到20%，鹽析過夜后冷凍離心（4 ℃、10 000 r/min離心20 min）除去沉淀得上清液。逐次在所得上清液中緩慢加入（NH4）2SO4（注意低溫條件下緩慢加入且不斷攪拌，以防止因部分（NH4）2SO4質量分數過高導致蛋白質的結構和活性變化），使（NH4）2SO4溶液質量分數依次達到30%、40%、50%、60%、70%。低溫靜置過夜，高速冷凍離心，透析，真空冷凍干燥得不同鹽析條件下的蛋白質粉末。

1.3.3雙水相萃取體系的優化

1.3.3.1雙水相體系相圖的繪制

參考Albertsson［17］濁點法，分別配制40%的PEG 1 500、4 000、6 000、8 000溶液和40%的（NH4）2SO4溶液，稱取0.700 g的PEG于大試管中，加0.5 mL水，然后向內滴入（NH4）2SO4溶液，直到溶液剛好變渾濁，記下滴定體積，重復以上加水和滴定操作，分別計算出每次達到渾濁時溶液中PEG和（NH4）2SO4的質量分數［18］。以（NH4）2SO4質量分數為橫坐標，PEG質量分數為縱坐標繪制相圖。

1.3.3.2葛仙米藻藍蛋白的雙水相萃取體系

取1.3.2節40%和50%鹽析所得產物作為雙水相萃取實驗材料進行雙水相萃取實驗。

稱取一定質量（NH4）2SO4和PEG于15 mL帶刻度試管中，加蒸餾水漩渦混勻使其完全溶解，加入10 mg/mL的葛仙米藻膽蛋白粗提液2 mL，蒸餾水調至體系總質量為10 g。混勻后避光萃取30 min，2 000 r/min離心5 min，待徹底分層后讀取上下相體積，多功能酶標儀分別測定上下相在波長280、568 nm和615 nm處的吸光度，據公式（1）～（5）［10］計算藻藍蛋白的回收率和純度。

式（1）～（5）中：C、Ct、Cb分別為藻藍蛋白、上相藻藍蛋白和下相藻藍蛋白的質量分數/%；K為分配系數；R為相比；Vt為上相體積/mL；Vb為下相體積/mL；Ep為藻藍蛋白純度；A280 nm和A615 nm分別為相應波長條件下的吸光度；Y為藻藍蛋白回收率/%。

1.3.3.3PEG相對分子質量對葛仙米藻藍蛋白萃取效果的影響

依據1.3.3.1節方法所得相圖，選取一定質量分數PEG和（NH4）2SO4組成雙水相體系。取40%和50%鹽析所得藻膽蛋白作為雙水相萃取實驗材料，按照1.3.3.2節方法進行雙水相萃取。以葛仙米藻藍蛋白的純度和回收率為主要參考指標，分別考察相對分子質量為1 500、4 000、6 000、8 000的PEG對雙水相萃取效果的影響。

1.3.3.4PEG質量分數對葛仙米藻藍蛋白萃取效果的影響

在1.3.3.3節基礎上選取相對分子質量最優的PEG，并分別配制成6%、8%、10%、12%、14%的PEG溶液，和一定質量分數（NH4）2SO4構成雙水相體系，得出PEG質量分數對雙水相萃取藻藍蛋白效果的影響。

1.3.3.5（NH4）2SO4質量分數對葛仙米藻藍蛋白萃取效果的影響

參考1.3.3.4節結果，選用最優質量分數的PEG，分別和質量分數為12%、14%、16%、18%、20%的（NH4）2SO4溶液構成雙水相體系，得出（NH4）2SO4質量分數對雙水相萃取效果的影響。

1.3.3.6中心組合試驗設計

基于單因素試驗結果，運用中心組合試驗設計原理，對顯著影響雙水相萃取藻藍蛋白純度的3 個因素PEG相對分子質量（X1）、PEG質量分數（X2）、（NH4）2SO4質量分數（X3）做三因素三水平響應面分析試驗（表1）。

表1　響應面設計因素水平表Taabbllee 11 　FFaaccttoorrss aanndd lleevveellss uusseedd iinn tthhee cceenntteerr ccoommppoossiittee ddeessiiggnn

1.3.4藻膽蛋白的質量及純度分析

分別稱量1.3.2節各鹽析條件下所得葛仙米藻膽蛋白，并按式（6）計算得率。

分別稱取1.3.2節鹽析所得藻膽蛋白及1.3.3節雙水相萃取所得藻藍蛋白，配成1 mg/mL溶液，于紫外-可見光分光光度計下進行光譜掃描，掃描波長250～750 nm，得光譜掃描曲線。

1.3.5SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）分析

配制溶液：3.0 mol/L pH 8.9的Tris-HCl分離膠緩沖液；0.5 mol/L pH 6.7的Tris-HCl濃縮膠緩沖液；pH 8.3的Tris（0.05 mol/L）-甘氨酸（0.384 mol/L）電極緩沖液；50%甲醇溶液和冰醋酸按一定比例混合成固定液；考馬斯亮藍G-250染色液；樣品溶解液；甲醇和冰醋酸混合配制成脫色液。

制膠：按一定要求和比例分別配制質量分數為3%的濃縮膠和12.5%的分離膠［19］。

樣品處理：稱取雙水相萃取所得葛仙米藻藍蛋白粉末，配成2 mg/mL溶液，樣品溶解液溶解，煮沸5 min冷卻后上樣，上樣量20 μL，標準蛋白上樣量5 μL。

電泳：連接電泳裝置，放入適量電極緩沖液后開始電泳。初始電流穩定在10 mA左右，待樣品完全進入分離膠后，電流調至20～30 mA。待染料前沿距離膠片底部1.5 cm時停止電泳。小心取出膠片，蒸餾水浸泡10 min以除去殘留的SDS，放入固定液中固定1 h，染色液染色1 h，脫色液中脫色（前期每隔0.5 h換一次脫色液）直到膠帶清晰透明為止。

1.3.6葛仙米藻藍蛋白的質譜鑒定

切下電泳膠片上的條帶1和條帶2，經除鹽、濃縮，于2 μL基質（含5 mg/mL的α-4-羥基肉桂酸的50%硝酸鈰銨，0.1%三氟乙酸溶液）中混合溶解后點樣。利用質譜儀進行質譜分析。紫外波長為355nm，重復速率為200 Hz，加速電壓為20 000 V，最優質量分辨率為1 500 D，掃描質量范圍為700～3 200 D［20-21］。

利用軟件Mascot distiller過濾基線峰、識別信號峰。利用Matrixscience公司的Mascot軟件搜索IPI_mouse數據庫，尋找匹配的相關蛋白質，同時查詢其功能，來明確鑒定的蛋白質種類。

2　結果與分析

2.1逐級鹽析法所得藻膽蛋白分析

2.1.1逐級鹽析所得藻膽蛋白得率和藻藍蛋白純度分析

表2　逐級鹽析所得純度和得率Taabbllee 22 　TThhee ppuurriittyy ooff pphhyyccoobbiilliipprrootteeiinn ssaalltteedd oouutt wwiitthh ddiiffffeerreenntt concentrations of ammonium sulfattee

如表2所示，不同質量分數（NH4）2SO4鹽析所得蛋白質得率不同，其中60%鹽析蛋白質得率最大。（NH4）2SO4質量分數在30%～50%范圍內逐級鹽析時，藻膽蛋白的得率隨著質量分數的增大而增大。實驗觀察發現，30%鹽析產物呈紅棕色，60%鹽析產物呈淡藍色，70%鹽析產物呈淡粉色，40%和50%鹽析產物呈深藍色。由產物顏色推斷：30%鹽析產物可能大部分是雜蛋白；40%和50%鹽析產物中可能含有較大量的藻藍蛋白；60%鹽析產物中可能僅含少量藻藍蛋白；70%鹽析產物中可能幾乎不含藻藍蛋白。40%和50%鹽析產物中藻藍蛋白純度可達到1以上。與先20%后60%鹽析的方法比較，逐級鹽析法可以逐級除去粗提液中的雜質，得到純度較高的藻藍蛋白。

2.1.2逐級鹽析藻膽蛋白紫外-可見掃描圖譜

圖 1　逐級鹽析藻膽蛋白紫外-可見光譜掃描曲線Fig.1　UV-Vis spectra of phycobiliprotein purifi ed by stepwise salting-out

如圖1所示，40%和50%鹽析產物在波長280 nm處有較高峰值，在可見光區有明顯的兩個峰，且615 nm波長處（藻藍蛋白）的峰值高于波長568 nm處（藻紅蛋白）的峰值。說明這部分鹽析產物中含有大量藻膽蛋白，且前者含量高于后者。30%鹽析產物在波長280 nm處有較高的吸收峰，但568 nm和615 nm波長處的峰值較小，表明這部分物質中雖含有較多的蛋白質，但藻紅蛋白和藻藍蛋白的含量較低，也可能是藻藍蛋白和藻紅蛋白在處理過程中丟失了色基基團。60%和70%鹽析產物在波長280 nm處的吸收很少，說明這兩部分物質中蛋白質含量少。結合表2各質量分數逐級鹽析產物質量判斷，主要雜質可能在60%鹽析時被除去。通過以上比較可以看出，逐級鹽析方法可有效除去蛋白質中的其他成分，得到純度較高的藻藍蛋白和藻紅蛋白。

2.2葛仙米藻藍蛋白的雙水相萃取

圖 2　PEG 1 500、4 000、6 000、8 000和（NH4）2SSOO4雙水相相圖Fig.2　Two-phase aqueous diagrams with PEG 1 500， 4 000，6 000 or 8 000/（NH4）2SO4

2.2.1PEG-（NH4）2SO4雙水相系統相圖圖2為4 種不同相對分子質量PEG和（NH4）2SO4組成雙水相體系的相圖。曲線下方各點為均勻混合體系，曲線上各點為臨界點，曲線上方各點為兩相區。從圖2可以看出，PEG相對分子質量越小，體系分相需要（NH4）2SO4和

PEG質量分數越高。當PEG質量分數一定時，PEG相對分子質量越小，形成雙水相所需的（NH4）2SO4質量分數越大。實驗過程中發現，PEG相對分子質量越高，越難在水中溶解，且溶解分相后PEG相黏度越大。這可能是由于PEG相對分子質量越大憎水能力越強所致。

2.2.2雙水相萃取單因素試驗結果

2.2.2.1PEG相對分子質量對雙水相萃取效果的影響

圖 3　PEG相對分子質量對萃取效率的影響Fig.3　Infl uence of PEG molecular weight on the extracting effi ciency

選擇質量分數12%的PEG和16%的（NH4）2SO4組成雙水相體系。萃取分層后藻藍蛋白富集在上相PEG相，上相為藍綠色，下相無色。如圖3所示，純度和回收率呈現相反的變化趨勢，純度高時回收率低，回收率高時純度低。各體系的回收率均在50%以上，PEG 6 000與（NH4）2SO4形成雙水相體系萃取出的藻藍蛋白純度可達3.5以上，比其他體系的純度高出2 倍以上。故選擇PEG 6 000為最佳的相對分子質量。

2.2.2.2PEG質量分數對雙水相萃取效果的影響

圖 4　PEG質量分數對雙水相體系萃取效果的影響Fig.4　Effect of PEG percentage on the purity and recovery of phycobiliprotein

用不同質量分數的PEG 6 000和16%（NH4）2SO4形成雙水相體系，萃取藻藍蛋白。結果如圖4所示，隨著PEG質量分數提高，藻藍蛋白純度和回收率均逐漸提高。14%的PEG 6 000和（NH4）2SO4形成體系萃取所得藻藍蛋白的純度和回收率均明顯高于其他體系，純度可達到4以上，回收率近60%。所以選擇14%為PEG 6 000的最佳質量分數。

2.2.2.3（NH4）2SO4質量分數對雙水相萃取效果的影響

圖5?。∟NHH4）2SSOO4質量分數對雙水相體系萃取效果的影響Fig.5　Effect of （NH4）2SO4concentration on the purity and recovery of phycobiliprotein

用不同質量分數的（NH4）2SO4和14% PEG 6 000構成雙水相體系，如圖5所示，（NH4）2SO4質量分數在14%～18%變化時，體系萃取藻藍蛋白的純度和回收率隨著質量分數的增大而提高。18% （NH4）2SO4和14%的PEG 6 000形成體系萃取出的藻藍蛋白純度和回收率優于其他組，但是試驗過程中發現，18% （NH4）2SO4與PEG形成雙水相體系時，由于（NH4）2SO4質量分數太大不易溶解，且形成的體系黏度較大不易分相，不利于實際操作，故選擇16%為（NH4）2SO4的最佳質量分數，該體系萃取藻藍蛋白的純度在4左右，回收率可達到90%以上。

2.2.3葛仙米藻藍蛋白雙水相萃取回歸模型的建立

在單因素試驗基礎上，根據中心組合試驗設計原理［22］設計了17 組試驗，分別測定并計算各組藻藍蛋白的純度和回收率，試驗結果見表3。

表3　中心組合試驗設計及結果Taabbllee 33 　EExxppeerriimmeennttaall ddeessiiggnn mmaattrriixx wwiitthh eexxppeerriimmeennttaall rreessuullttss

用Design-Expert 7.0軟件對表3結果進行分析，得出各影響因素的效應及其交互效應的關聯方程［23］。利用軟件對雙水相萃取工藝條件進行優化，得出響應面圖。本研究重點考慮葛仙米藻藍蛋白的純度，因此多元回歸擬合主要以葛仙米藻藍蛋白純度作為響應值，分析得到葛仙米藻藍蛋白純度與各因素變量的二次方程模型為：y=－696.63+ 0.02X1+37.03X2+47.65X3－5.45×10－4X1X2－2.30×10－4X1X3－1.41X2X3－7.70×10－7X12－0.41X2

2－0.83X32。2.2.4最佳雙水相萃取工藝方差分析及響應面優化

表 4　響應面法方差分析Taabbllee 44 　AAnnaallyyssiiss ooff vvaarriiaannccee （AANNOOVVAA） ffoorr qquuaaddrraattiicc rreessppoonnssee ssuurrffaaccee mmooddeell

由表4的方差分析可知，各因素中，一次項X1、X2、X3不顯著，X2X3顯著，X12極顯著。由此可見，各影響因素與響應值之間不呈簡單的線性相關關系。由方差分析結果看出，回歸模型也是顯著的，相關系數R2=61.457/70.793=0.868，說明響應值（藻藍蛋白純度）有86.8%的變化由試驗各影響因素決定，即PEG相對分子質量、PEG質量分數和（NH4）2SO4質量分數。因此，該方程可以對試驗各因素與響應值之間的真實關系進行較好的描述，可利用此回歸模型對實驗可能產生的真實結果進行預測和分析［24］，得出最佳雙水相萃取工藝條件。

圖 6　各因素交互作用的響應面與等高線Fig.6　Response surface plot and contour plot showing the effects of process conditions on phycobiliprotein purity

由圖6響應面3D圖和等高線分析圖可以直觀地看出各個因素的交互作用［25］。PEG相對分子質量與（NH4）2SO4質量分數交互作用較強，在因素所選范圍內響應值存在極值，即響應面的最高點，也是等高線最小橢圓的中心點，較大的X1、X3反而使響應值趨于減小。這可能是由于PEG相對分子質量過大或者（NH4）2SO4質量分數過大反而阻止了蛋白質分子進入體系上相PEG相，從而分離效果變差。X1、X2之間也有交互作用，但是相對于X1、X3的交互作用較弱，X2、X3之間沒有明顯的交互作用。

由Design-Expert 7.0軟件擬合二次回歸模型預測得到最佳萃取工藝為PEG相對分子質量6 000、（NH4）2SO4質量分數18.29%、PEG質量分數10%，藻藍蛋白純度為8.6，回收率為71.40%?？紤]到實際操作和生產的便利，最佳工藝確定為PEG相對分子質量6 000、（NH4）2SO4質量分數18%、PEG質量分數10%。

2.2.5雙水相萃取藻藍蛋白純度分析

2.2.5.1雙水相萃取藻藍蛋白光譜掃描分析

圖 7　雙水相萃取藻藍蛋白紫外-可見光譜掃描曲線Fig.7　UV-Vis spectra of phycocyanin extracted by aqueous two-phase system

由圖7可知，雙水相萃取可以純化粗提液，去除雜質成分，從而得到純度較高的藻藍蛋白。

2.2.5.2雙水相萃取藻藍蛋白的SDS-PAGE

雙水相萃取得到的蛋白質經SDS-PAGE電泳，如圖8所示，圖譜上有清晰的顏色很深的兩條帶，其他條帶較少且顏色較淺。說明經過雙水相萃取，得到了葛仙米藻藍蛋白中雜質含量少，純度較高。且由圖8可知，蛋白質經SDS-PAGE得到兩條帶（條帶1和條帶2），條帶1的分子質量在35 ku左右，條帶2的分子質量在15 ku左右。

圖 8　雙水相萃取蛋白質的SDS-PAGGEE圖Fig.8　SDS-PAGE analysis of phycocyanin extracted by aqueous two-phase system

2.2.5.3萃取后的藻藍蛋白的質譜鑒定

通過質譜儀進行分析，并與Synpcc7942_1048數據進行對比，可知條帶2的分子質量約為15 ku，等電點為5.35。匹配肽的氨基酸序列（斜體加黑表示）見圖9a。

利用SWISS-MODEL網站對其蛋白結構進行模擬，結果見圖9b，通過結構模擬得出，此氨基酸序列可能是藻藍蛋白的α亞基。

圖 9　條帶2的氨基酸序列（a）和模擬蛋白結構（bb）Fig.9　Amino acid sequence （a） and simulated protein structure （b） of band 2

33　結 論

本研究首先用（NH4）2SO4逐級鹽析法獲得葛仙米藻膽蛋白，然后在此基礎上用雙水相萃取技術對所得產物進一步純化，并對所得產物的質量和純度進行分析。實驗發現，通過逐級鹽析的方法，可有效除去雜質成分，明顯提高產物中藻藍蛋白純度。與先用20%后用60%鹽析方法相比，通過20% （NH4）2SO4鹽析除雜后對上清液采用30%、40%、50%、60%、70% （NH4）2SO4逐級鹽析法，可使藻藍蛋白純度提高近1倍，產物的純度可達1.1左右。用雙水相萃取法對逐級鹽析所得純度在1.1左右葛仙米藻膽蛋白進一步純化，并通過中心組合試驗設計，對實驗結果進行響應面分析，從而對萃取工藝進行優化，得到最佳工藝條件為：PEG相對分子質量6 000、（NH4）2SO4質量分數18%、PEG質量分數10%。按照此工藝所得藻藍蛋白純度為8.6，回收率為71.40%。

通過Design-Expert 7.0軟件分析并建立了響應值（葛仙米藻藍蛋白純度）與各因素之間的數學模型y=－696.63+ 0.02X1+37.03X2+47.65X3－5.45×10－4X1X2－2.30×10－4X1X3－1.41X2X3－7.70×10－7X12－0.41X22－0.83X32，該模型回歸顯著，且對試驗有較好的擬合度，可用于指導生產。

對雙水相萃取所得藻藍蛋白進行SDS-PAGE分析，得到清晰的兩條條帶（條帶1和條帶2），其分子質量分別在35 ku（條帶1）和15 ku（條帶2）左右。通過質譜分析可知，條帶2的分子質量為15 ku左右，等電點5.35，部分肽的氨基酸序列為TPLTEAVAAADSQGR和DIGYYLR。通過SWISS-MODEL網站模擬蛋白質結構得出，條帶2可能是葛仙米藻藍蛋白的α亞基。

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Purifi cation of Phycocyanin from Nostoc spharoids Kützing by Stepwise Salting-out and Aqueous Two-Phase Extraction

TIAN Panpan1， CHENG Chao1，2， WANG Xingping1，2，*
（1. School of Biological Science and Technology， Hubei University for Nationalities， Enshi445000， China； 2. Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization of Hubei Province， Hubei University for Nationalities， Enshi445000， China）

In this paper， stepwise salting-out combined with aqueous two-phase extraction was used to purify phycocyanin from Nostoc spharoids Kützing. The extraction process was optimized by using a three-factor quadratic regression orthogonal rotation combination design. Using the Design-Expert 7.0 software， a mathematical regression model was established indicating the effect of various extraction conditions on phycocyanin purity. The optimal extraction process was determined as follows: after discarding of the precipitate salted out by 20% （NH4）2SO4， phycobiliproteins were salted out from the supernatant by 40% and 50% （NH4）2SO4before being subjected to aqueous two-phase extraction with 10% PEG 6 000 and 18% （NH4）2SO4. The purity （the absorbance ratio at 615 nm and 280 nm） and recovery of the purified product under the optimized conditions were 8.6 and 71.40%， respectively. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） analysis of the product revealed two clear bands having molecular weights of about 35 and 15 ku， respectively. Mass spectrometry （MS） analysis confi rmed that the molecular weight of band 2 was about 15 ku . Its isoelectric point was 5.35 and its partial amino acid sequences were TPLTEAVAAADSQGR and DIGYYLR， respectively. Through simulation of protein structure according to the SWISS-MODEL website， we speculated that band 2 might be the α-subunit of phycocyanin from Nostoc spharoids Kützing.

Nostoc spharoids Kützing； phycocyanin； stepwise salting-out； aqueous two-phase extraction；

TS201.1

A

1002-6630（2015）24-0016-07

10.7506/spkx1002-6630-201524003

2015-06-24

國家自然科學基金地區科學基金項目（31260365）；湖北省教育廳團隊項目（T201312）

田盼盼（1989—），女，碩士研究生，研究方向為天然產物開發與利用。E-mail：1003939513@qq.com

汪興平（1963—），男，教授，博士，研究方向為生物資源的開發與利用。E-mail：hbmywxp@163.com