響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化雙水相萃取大吳風(fēng)草總黃酮工藝及抑菌活性測(cè)定

陳建中，葛水蓮，昝立峰，邢浩春，付 靜，王更先（.邯鄲學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河北 邯鄲　056005；2.冀南太行山區(qū)野生資源植物研發(fā)中心，河北 邯鄲　056005）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化雙水相萃取大吳風(fēng)草總黃酮工藝及抑菌活性測(cè)定

陳建中1，2，葛水蓮1，昝立峰1，邢浩春1，付 靜1，王更先1
（1.邯鄲學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河北 邯鄲056005；2.冀南太行山區(qū)野生資源植物研發(fā)中心，河北 邯鄲056005）

目的：優(yōu)化大吳風(fēng)草總黃酮（total flavonoids of Farfugium，TFF）雙水相萃取體系并研究其抑菌活性。方法：超聲波輔助C2H5OH-（NH4）2SO4雙水相萃取TFF，依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法，以TFF萃取率為響應(yīng)值進(jìn)行方差分析，獲取多元二次線(xiàn)性回歸方程；采用K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)定6 種供試菌種的抑菌圈直徑，對(duì)比最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）確定其抑菌活性。結(jié)果：24% C2H5OH-18% （NH4）2SO4雙水相萃取體系條件下TFF萃取率最高，響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析表明，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著影響TFF萃取率（P=0.023 9＜0.05），而pH值和NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取率的影響不顯著；最佳雙水相萃取條件為粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、pH 7.64、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.68%，萃取率模型預(yù)測(cè)最大值為96.366 7%（P=0.994）；TFF對(duì)枯草芽孢桿菌抑制作用最強(qiáng)，高劑量作用下抑菌率可達(dá)98.67%，MIC為1.56 mg/mL；對(duì)沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑制作用次之，對(duì)青霉和黑曲霉抑制作用最弱。結(jié)論：粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取率影響較大，pH值和NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取率的影響較小；TFF對(duì)6 種供試菌種均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，抑菌率與TFF質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，TFF對(duì)細(xì)菌的抑制效果相對(duì)強(qiáng)于真菌。

響應(yīng)面優(yōu)化；雙水相萃取；黃酮類(lèi)物質(zhì)；大吳風(fēng)草；抑菌活性

黃酮類(lèi)物質(zhì)具有抗癌、抗病毒、抗心腦血管疾病、抗糖尿病并發(fā)癥、治療骨質(zhì)疏松等多種藥用作用［1-2］，研究［3-5］表明黃酮類(lèi)物質(zhì)具有很強(qiáng)的抗氧化作用，能清除人體中有害的超氧自由基團(tuán)，具有抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等生理活性。大吳風(fēng)草（Farfugium japonicum （L.f.）Kitam）為菊科管狀花亞科千里光族款冬亞族大吳風(fēng)草屬，多年生草本植物，全株入藥。大吳風(fēng)草的嫩葉和莖可作為蔬菜食用，“辛、溫、無(wú)毒，性涼、味苦”，并具有退熱、解毒、活血之功效。民間廣泛用于治療濕疹、咳嗽、支氣管炎、淋巴腺炎、痢疾等疾病［6］。大吳風(fēng)草作為藥食兩用的資源植物具有較高的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

雙水相萃取技術(shù)是廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物分離、生物提取、制藥、食品化工等領(lǐng)域的一種新型分離技術(shù)［7-8］。近年來(lái)由水溶性低級(jí)醇與鹽雙水相體系，克服了傳統(tǒng)雙水相技術(shù)成本高、效率低、目標(biāo)物回收處理較困難等問(wèn)題［9-10］，易與其他技術(shù)集成［11-12］，倍受人們關(guān)注。目前有關(guān)大吳風(fēng)草總黃酮雙水相萃取的工藝優(yōu)化和抑菌活性方面研究資料非常少，本實(shí)驗(yàn)旨在研究超聲波輔助雙水相技術(shù)萃取大吳風(fēng)草總黃酮（total fl avonoids of Farfugium，TFF）的工藝條件，通過(guò)響應(yīng)面法分析萃取條件的最優(yōu)組合，進(jìn)而分析TFF的抑菌活性，為開(kāi)發(fā)利用大吳風(fēng)草提供藥理和質(zhì)量控制的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與菌種

大吳風(fēng)草為冀南山區(qū)野生種類(lèi)，采集地上部分，采時(shí)株高多50～70 cm。材料去掉雜質(zhì)、洗凈塵土、瀝干水分，再于60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘至恒質(zhì)量，粉碎過(guò)40 目篩后備用。

供試菌種為E. coli ACCC11864、Salmonella ACCC01319、S. aureus ACCC01332、Bacillus subtilis ACCC01430、Penicillium ACCC30287、Aspergillus niger ACCC30005，由河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2儀器與設(shè)備

小型自動(dòng)粉碎機(jī)鄭州市烽火機(jī)械設(shè)備有限公司；L5紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)日本島津儀器公司；N-1100V-WP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀西安安泰儀器公司；YXQLS-75SⅡ高壓滅菌鍋上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；HWS-D80恒溫恒濕培養(yǎng)箱上海仙象儀器儀表公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制與TFF質(zhì)量濃度測(cè)定

參考徐春明［13］、趙強(qiáng)［14］等的方法，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出吸光度（y）和質(zhì)量濃度（x）的回歸方程：y=9.12x－0.023，R2=0.998 6，線(xiàn)性回歸關(guān)系良好。吸取樣品液1 mL，用70%乙醇溶液補(bǔ)至5 mL，加入5% NaNO2溶液0.3 mL，搖勻置6 min；再加入10% A1（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻置6 min；加4% NaOH溶液4 mL，用蒸餾水定容至10 mL，搖勻15 min后測(cè)定吸光度，得到TFF質(zhì)量濃度，重復(fù)3 次求平均值［15］。

1.3.2低級(jí)醇與鹽雙水相體系的建立

考察乙醇與無(wú)機(jī)鹽雙水相體系對(duì)一定質(zhì)量濃度目標(biāo)萃取物的萃取能力，配制乙醇和無(wú)機(jī)鹽比例形成穩(wěn)定的雙水相體系，加入目標(biāo)萃取物，充分振蕩使體系完全混合，離心后取樣，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定上下相的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算上下相TFF質(zhì)量濃度，按式（1）～（3）計(jì)算體系的相比（R）、分配系數(shù)（K）和萃取率（Y）［16-17］。

式（1）～（3）中：Vt、Vb分別為上下相體積/mL，Ct、Cb分別為上下相目標(biāo)萃取物的質(zhì)量濃度/（mg/mL）。1.3.3響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

確定了C2H5OH-（NH4）2SO4雙水相體系兩相最佳組成后，重點(diǎn)研究黃酮粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值和NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)TFF萃取率的影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，借助Design-Expert 8.0設(shè)計(jì)三因素三水平17 個(gè)試驗(yàn)處理的響應(yīng)面試驗(yàn)，分析TFF雙水相萃取的最佳工藝條件［18-20］。

1.3.4TFF抑菌率的測(cè)定

采用K-B紙片擴(kuò)散法，在無(wú)菌的條件下，取100 μL菌種于瓊脂培養(yǎng)基（muller hinton agar，MHA）內(nèi)，密封并輕輕搖勻，置于搖床37 ℃培養(yǎng)18 h。取適量種供試菌液于試管中，稀釋成0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度。將蘸取供試藥溶液直徑為7 mm的無(wú)菌濾紙片，均勻擺放在涂有菌懸液的MHA培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿中均擺放4 個(gè)紙片，分別配制高、中、低3 個(gè)劑量的TFF和陽(yáng)性對(duì)照藥物：苯甲酸鈉，做5 次平行實(shí)驗(yàn)。將培養(yǎng)皿密封后置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18 h，采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。以抑菌圈直徑（A）和抑菌率（R）來(lái)評(píng)判供試藥物的抑菌活性［21-22］，見(jiàn)式（4）。

式中：R為抑菌率/%；A為供試藥抑菌圈直徑/mm；B為陽(yáng)性藥抑菌圈直徑/mm；c為濾紙片直徑/mm。

1.3.5最小抑菌濃度（m i n i m u m i n h i b i t o r y concentration，MIC）和最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）的測(cè)定

在無(wú)菌條件下，將滅菌試管根據(jù)供試菌種的類(lèi)型分為6 組，每組12 支。具體配制如下：第Ⅰ支加入2 倍質(zhì)量濃度的LB液體培養(yǎng)基2 mL，第Ⅱ～Ⅹ支試管加入LB液體培養(yǎng)基2 mL，向第Ⅰ支試管中加入TFF提取液2 mL，按照2 倍稀釋法，使各管藥液質(zhì)量濃度依次為：50.00、25.00、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.20、0.00 mg/mL，然后向這10 支試管中分別加入各菌種的菌懸液0.1 mL，第Ⅺ支管作為陽(yáng)性對(duì)照，僅加入中LB液體培養(yǎng)基2 mL，第Ⅻ支管作為陰性對(duì)照，加入2 倍質(zhì)量濃度的LB液體培養(yǎng)基1 mL和TFF提取液1 mL。將上述設(shè)置試管置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，從12 支試管中分別取0.1 mL涂布于固體LB培養(yǎng)基平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以24 h不長(zhǎng)菌的總黃酮溶液質(zhì)量濃度為MIC，以48 h不長(zhǎng)菌的提取液質(zhì)量濃度為MBC［23-25］。

2　結(jié)果與分析

2.1雙水相萃取TFF體系的建立和評(píng)價(jià)

2.1.1乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)TFF分相萃取的影響

室溫（25 ℃）條件下，C2H5OH-（NH4）2SO4雙水相萃取體系組成如下：無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為20%、22%、24%、26%、28%，固定（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)22%、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，攪拌至兩相充分混勻，對(duì)上下相溶液進(jìn)行定量分析。

圖 1　乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)TFF分相萃取的影響Fig.1　Effect of ethanol concentration on partitioning behavior of TFF

如圖1所示，隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，TFF萃取率和分配系數(shù)都有所增加，主要原因是黃酮在乙醇中的溶解度大于水中的溶解度，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，提高了雙水相體系的分相能力。當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到24%時(shí)，TFF萃取率和分配系數(shù)都達(dá)到最大值，而后，隨乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，TFF萃取率和分配系數(shù)都顯著下降，可能是乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，下相中TFF的質(zhì)量濃度也在增加，從而抑制了TFF的析出，因此確定C2H5OH-（NH4）2SO4雙水相萃取體系最佳的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%。

2.1.2（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)TFF分相萃取的影響

室溫（25 ℃）條件下，C2H5OH-（NH4）2SO4雙水相萃取體系組成如下：（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為16%、18%、20%、22%、24%，固定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)24%、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，攪拌至兩相充分混勻，對(duì)上下相溶液進(jìn)行定量分析。

圖2　（NNHH4）2SSOO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)TFF分相萃取的影響Fig.2　Effect of （NH4）2SO4mass fraction on partitioning behavior of TFF

如圖2所示，隨著（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，TFF萃取率和分配系數(shù)先是逐漸上升，在（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%時(shí)，TFF萃取率和分配系數(shù)都達(dá)到最大值，當(dāng)（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，雙水相體系在（NH4）2SO4沉淀析出同時(shí)，TFF的析出速率會(huì)受到抑制，導(dǎo)致萃取率和分配系數(shù)隨（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而下降，因此C2H5OH-（NH4）2SO4雙水相萃取體系中（NH4）2SO4的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%。

2.2雙水相萃取TFF單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)TFF分相萃取的影響

室溫（25 ℃）條件下，24% C2H5OH-18% （NH4）2SO4雙水相萃取體系粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為10%、12%、14%、16%、18%、20%，攪拌至兩相充分混勻，對(duì)上下相溶液進(jìn)行定量分析。

圖 3　粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)TFF分相萃取的影響Fig.3　Effect of crude extract concentration on partitioning behavior of TFF

如圖3所示，粗提液添加量直接影響TFF萃取量，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響C2H5OH-（NH4）2SO4雙水相萃取體系上下相的萃取率和分配系數(shù)，基本變化規(guī)律曲線(xiàn)相似，當(dāng)粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加時(shí)，上相萃取率和雙水相分配系數(shù)都呈現(xiàn)先降后升的相似變化規(guī)律曲線(xiàn)，當(dāng)粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%時(shí)，二者都到最大值，因此24% C2H5OH-18% （NH4）2SO4雙水相萃取體系最佳TFF粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%。

2.2.2pH值對(duì)TFF雙水相萃取分相的影響

室溫（25 ℃）條件下，24% C2H5OH-18%（NH4）2SO4雙水相萃取體系中粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%，通過(guò)NaOH和HCl調(diào)節(jié)雙水相體系pH值分別為5、6、7、8、9、10，攪拌至兩相充分混勻，對(duì)上下相溶液進(jìn)行定量分析。

圖4　pH值對(duì)TFF分相萃取的影響Fig.4　Effect of pH on partitioning behavior of TFF

如圖4所示，24% C2H5OH-18% （NH4）2SO4雙水相萃取體系中萃取率和分配系數(shù)都呈現(xiàn)先增后降的規(guī)律，pH值小于7時(shí)，分配系數(shù)和萃取率隨著pH值升高逐漸增大；pH值為7時(shí)，分配系數(shù)和萃取率達(dá)到最大值；當(dāng)pH值大于7堿性條件時(shí)，隨pH值的升高分配系數(shù)和萃取率在下降。由于24% C2H5OH-18% （NH4）2SO4雙水相萃取體系上下相的電荷特性，酸性條件下，TFF電解后電離平衡使之?dāng)y帶上正電荷，TFF向帶有負(fù)電荷的下相富集，分配系數(shù)隨之下降；而在堿性條件下，黃酮的母核易被羥基破壞，降低TFF的萃取率。因此24% C2H5OH-18% （NH4）2SO4雙水相萃取體系最佳pH值為7。

2.2.3NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)TFF雙水相萃取分相的影響

圖 5　NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)TFF分相萃取的影響Fig.5　Effect of NaCl concentration on partitioning behavior of TFF

室溫（25 ℃）條件下，24% C2H5OH-18% （NH4）2SO4雙水相萃取體系中，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%、pH 7.0，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、 3.0%，攪拌至上下相兩相充分混勻，對(duì)兩相溶液進(jìn)行定量分析。

由圖5所示，隨著萃取體系中NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，萃取效率的兩個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)分配系數(shù)和萃取率二者呈現(xiàn)同步變化趨勢(shì)。對(duì)比兩個(gè)指標(biāo)變化曲線(xiàn)，分配系數(shù)曲線(xiàn)變化較為平緩，而萃取率的變化較大，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%時(shí)，二者都達(dá)到最大值。NaCl對(duì)萃取體系的主要作用是改變上下兩相的電荷性，從而改變兩相間電位差，加速TFF的萃取和分離速度，增加TFF在上相中的含量，縮短兩相分相時(shí)間，黃酮溶解度下降的同時(shí)，分配系數(shù)增至50后降低。因此24% C2H5OH-18% （NH4）2SO4雙水相萃取體系NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%。

2.3響應(yīng)面法優(yōu)化TFF提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析

2.3.1試驗(yàn)結(jié)果與模型建立

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，做三因素三水平共17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)（5 個(gè)中心點(diǎn)）的響應(yīng)面分析試驗(yàn)（表1）。試驗(yàn)點(diǎn)可分為兩大類(lèi)：三變量各水平所構(gòu)成12 個(gè)三維析因點(diǎn)；零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5 次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差，TFF萃取率為響應(yīng)值。

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Taabbllee 11 　AArrrraannggeemmeenntt aanndd rreessuullttss ooff rreessppoonnssee ssuurrffaaccee mmeetthhooddoollooggyy

表2　萃取率影響因子二次回歸模型方差分析TTaabbllee 22 　AAnnaallyyssiiss ooff vvaarriiaannccee ooff qquuaaddrraattiicc rreeggrreessssiioonn mmooddeell ffoorr TTFFFF

由表2分析可知，（P=0.023 9＜0.05）二次回歸方程模型顯著，失擬項(xiàng)不顯著（P=0.194 9＞0.05）。通過(guò)該模型的方差分析可知，A對(duì)萃取率的影響極顯著，B和C對(duì)萃取率的影響不顯著，即pH值和NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取率的影響不顯著，而粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著響雙水相萃取體系的TFF萃取率。各因素對(duì)TFF萃取率影響效應(yīng)的大小依次為粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞pH值＞NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)。經(jīng)回歸模型擬合，三因素對(duì)響應(yīng)值Y的影響可用以下多元二次方程表示：

Y=94.28+1.98A+0.34B+0.26C－0.2AB+0.25AC+ 0.38BC－0.002 5A2－0.43B2－0.88C2

2.3.2各因素交互作用響應(yīng)面與優(yōu)化驗(yàn)證

圖 6　各因素交互作用對(duì)萃取率影響的響應(yīng)面分析Fig.6　Response surface analysis of the effect of process parameters on the extraction effi ciency of TFF

如圖6所示，萃取率的響應(yīng)面開(kāi)口向下，萃取率和雙水相萃取體系中的3個(gè)制約因素呈現(xiàn)明顯的二次拋物線(xiàn)關(guān)系。隨著每個(gè)因素水平的增加，響應(yīng)值萃取率也在增大。根據(jù)浸提動(dòng)力學(xué)理論，隨著三因素的增加，響應(yīng)值萃取率出現(xiàn)最大值，后隨著三因素水平繼續(xù)增加，萃取率呈現(xiàn)不同斜率的下降，該回歸模型具有穩(wěn)定點(diǎn)，穩(wěn)定點(diǎn)是最大值。借助Design-Expert 8.0中多元二次回歸模型對(duì)TFF萃取率進(jìn)行估算，對(duì)二次拋物線(xiàn)函數(shù)模型進(jìn)行極值分析，預(yù)測(cè)三因素的最佳組合坐標(biāo)Z（1，0.32，0.36），即粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、pH 7.64、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.68%，此時(shí)模型預(yù)測(cè)最大值Y=96.366 7%（P=0.994）。在Z坐標(biāo)條件下進(jìn)行3 組重復(fù)實(shí)驗(yàn)，TFF萃取率平均高達(dá)到98.8%，表明該回歸模型能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)TFF雙水相萃取情況。

2.4TFF體外抑菌活性結(jié)果

2.4.1TFF體外抑菌直徑及抑菌率測(cè)定結(jié)果

表3　6 種供試菌種在不同劑量條件下的抑菌圈直徑和抑菌率Table 3 Diameter of inhibition zone and bacteriostasis rate of six

如表3所示，TFF對(duì)6 種供試菌種均表現(xiàn)出良好的抑菌活性，而且6 種供試菌種對(duì)TFF的耐受性個(gè)體差異明顯。高劑量作用下抑菌圈直徑可達(dá)（12.94±0.63）mm，和對(duì)照苯甲酸鈉作用抑菌圈直徑（13.02±0.12）mm相近，抑菌率高達(dá)98.67%，說(shuō)明其對(duì)枯草芽孢桿菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用很強(qiáng)；TFF對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球抑制作用次之；對(duì)青霉和黑曲霉抑制作用最弱，低劑量作用下，抑菌圈直徑僅為（8.83±0.34）mm，抑菌率只有20.68%。總之，各測(cè)試菌的抑菌圈直徑大小隨質(zhì)量濃度的增大而增大，抑菌率與TFF質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，TFF對(duì)細(xì)菌的抑制活性要強(qiáng)于其對(duì)真菌的作用。

2.4.2TFF體外抑菌MIC和MBC測(cè)定結(jié)果

表 4 6 種供試菌種MIC和MBC測(cè)定結(jié)果Table 4 Minimal inhibitory concentration and minimal bactericidal

如表4所示，TFF對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC為1.56 mg/mL，對(duì)沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的MIC為6.25 mg/mL，對(duì)大腸桿菌、青霉和黑曲霉的MIC為12.50 mg/mL。表明TFF對(duì)金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌均有很強(qiáng)的抑制活性，特別對(duì)枯草芽孢桿菌的抑作用最強(qiáng)，大腸桿菌、青霉和黑曲霉對(duì)其抑制作用耐受性較強(qiáng)。

33　結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)以大吳風(fēng)草為原料，利用C2H5OH-（NH4）2SO4雙水相技術(shù)對(duì)TFF進(jìn)行萃取條件的優(yōu)化，重點(diǎn)分析粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值和NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)3 個(gè)因素的作用規(guī)律。響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析表明，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著影響雙水相萃取體系中TFF萃取率，而pH值和NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取率影響不顯著。響應(yīng)面優(yōu)化24% C2H5OH-18% （NH4）2SO4雙水相萃取體系最佳配置組合坐標(biāo)Z（1，0.32，0.36），即粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、pH 7.64、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.68%，萃取率模型預(yù)測(cè)最大值為96.366 7%（P=0.994）。驗(yàn)證重復(fù)實(shí)驗(yàn)證明Box-Behnken設(shè)計(jì)法得到的模型擬合程度高，準(zhǔn)確有效，用于雙水相體系的優(yōu)化篩選是實(shí)踐可行的。

TFF對(duì)6 種供試菌均表現(xiàn)出良好的抑菌活性，而且6 種供試菌種對(duì)TFF的耐受性個(gè)體差異明顯，對(duì)枯草芽孢桿菌抑制活性較強(qiáng)，具有很高的開(kāi)發(fā)潛力；對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球抑制活性次之，而對(duì)青霉和黑曲霉抑制活性最弱。各測(cè)試菌種的抑菌圈直徑大小隨質(zhì)量濃度的增大而增大，TFF抑菌率與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，TFF對(duì)細(xì)菌的抑制活性要明顯強(qiáng)于其對(duì)真菌的作用。MIC和MBC實(shí)驗(yàn)也證明TFF對(duì)金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌均有很強(qiáng)的抑制活性，特別對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制活性最強(qiáng)，大腸桿菌、青霉和黑曲霉對(duì)其抑制作用耐受性較強(qiáng)。

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Optimization of Aqueous Two-Phase Extraction of Total Flavonoids from Farfugium japonicum （L. f.） Kitam by Response Surface Methodology and Antibacterial Activity

CHEN Jianzhong1，2， GE Shuilian1， ZAN Lifeng1， XING Haochun1， FU Jing1， WANG Gengxian1
（1. College of Life Science and Engineering， Handan College， Handan056005， China；2. Wild Resources Plant Research Center of South Hebei Mt. Taihang， Handan056005， China）

Objective: To optimize the aqueous phase extraction system for total fl avonoids （TFF） from the aboveground parts of Farfugium japonicum and to study the antibacterial activity of the extract. Methods: Ultrasonic was used to assist C2H5OH-（NH4）2SO4aqueous two-phase extraction of TFF， and the multivariate quadratic regression model using TFF yield as the response variable was established based on a Box-Behnken experimental design involving three factors at three levels each and subjected to analysis of variance （ANOVA） and response surface analysis. The Kirby-Bauer disk diffusion method was used to determine the diameters of inhibition zone of six tested strains and the minimum inhibitory concentration （MIC）and minimum bactericidal concentration （MBC） values were compared to study their antibacterial activities. Results: The 24% C2H5OH-18% （NH4）2SO4aqueous two-phase extraction system was found to be optimal to extract TFF. The results of ANOVA showed that mass fraction of TFF in crude ethanolic extracts signifi cantly affected the extraction rate of TFF （P = 0.023 9 ＜ 0.05）， but the effects of pH and NaCl concentration in the aqueous two-phase system were not signifi cant. The optimal extraction conditions were determined as follows: crude extract concentration， 20%； pH， 7.64； and NaCl concentration， 2.68%. Under these conditions， the maximum extraction rate of 96.366 7% （P = 0.994） was obtained. The inhibitory effect of TFF on Bacillus subtilis was the strongest with a percentage inhibition of 98.67% at high dose and an MIC of 1.56 mg/mL， followed by Salmonella， Staphylococcus aureus and Escherichia coli， and the inhibitory effects on Penicillium and Aspergillus niger were the weakest. Conclusions: The fl avonoid concentration of crude extracts had greater infl uence on the extraction rate of TFF than pH and NaCl. TFF showed obvious antibacterial activity against the six tested strains. The percentage inhibition was positively correlated to TFF concentration. The antibacterial activity of TFF was relatively stronger against bacteria than fungi.

response surface methodology； aqueous two-phase extraction； total fl avonoids； F. japonicurn （L. f.） Kitam；antimicrobial activity

2015-05-06

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目（13222907）；邯鄲市科技局項(xiàng)目（1422104057-2）；邯鄲學(xué)院校級(jí)項(xiàng)目（15202）

陳建中（1978—），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)樘烊皇乘幹参锘钚晕镔|(zhì)分析。E-mail：cjzhong@126.com

TS202.3

A

1002-6630（2015）24-0057-06

10.7506/spkx1002-6630-201524010