響應面試驗優化桑葉茶中游離氨基酸與多酚的提取工藝

王星天，李桂水，程麗君，李 毅，陶思佚，張 冰（天津市輕工與食品工程機械裝備集成設計與在線監控重點實驗室，天津科技大學機械工程學院，天津　300222）

響應面試驗優化桑葉茶中游離氨基酸與多酚的提取工藝

王星天，李桂水*，程麗君，李 毅，陶思佚，張 冰
（天津市輕工與食品工程機械裝備集成設計與在線監控重點實驗室，天津科技大學機械工程學院，天津300222）

為了使桑葉茶飲料達到較好的口感和較高營養價值，通過水浸提法同時提取桑葉茶中游離氨基酸與多酚兩種成分，利用響應面法對工藝參數進行優化。結果表明，桑葉茶最佳的浸提條件是浸提溫度89 ℃、水茶比87∶1 （mL/g）、浸提時間16 min。該條件下得到的游離氨基酸提取量為21.46 mg/g，多酚提取量為14.32 mg/g，與理論值誤差較小，說明通過Design-Expert軟件建立的二次多項數學模型準確可行，優化的浸提工藝穩定可靠，為桑葉茶飲料開發的相關研究提供了參考。

桑葉茶；響應面法；多酚；游離氨基酸；提取

桑葉又稱“東方神仙葉”，富含多種氨基酸、多酚、維生素、礦物質、植物纖維以及豐富的鉀、鈣，還有多種對人體有益的微量元素及多種生物活性物質［1-2］。其中氨基酸不僅是構成茶葉品質滋味的重要組成部分，而且它們對茶葉香氣的形成也有重要作用，在茶葉領域中的相關研究［3］表明，茶葉中氨基酸含量是決定茶葉品質級別的主要因素。桑葉茶中的多酚包括槲皮苷、槲皮素、綠原酸、蘆丁、沒食子酸等［4］。桑葉中多酚因其化學結構具有活潑的羥基氧，能在多酚氧化酶作用下終止生物體內自由基的連鎖反應，起到清除自由基和消除自由基毒性的作用［5］，從而表現出抗氧化［6］、抗衰老［7］、防治腫瘤［8］及增加機體免疫力［9］等多種生物活性。但在桑葉飲料的工藝研制［10］和生產［11］中對桑葉茶的浸提工藝都是通過感官評價指標來優化，有一定主觀性，缺乏準確數據支撐，且沒有考慮到各個影響因素之間的交互性。

響應面法是一種有效的試驗設計方法，該方法基于試驗數據，通過建立數學模型來解決受多因素影響的最優組合問題，可以在更廣泛的范圍內考慮因素的組合、預測響應值，比一次次的單因素分析方法更有效［12］。

本研究針對桑葉茶中含量較為豐富的游離氨基酸和多酚兩種有益成分同步進行提取工藝的研究，基于準確的數據，通過響應面法建立多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系［13］，充分考慮各因素之間的影響，從而得到兩種成分共同最優的提取工藝，使得桑葉茶浸提后從口感和保健的價值上都可以達到較高的水平，為以后的桑葉茶飲料制取的浸提工藝提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

谷氨酸標準品（純度99%）中國標準物質網；桑葉茶（每100 g含有氨基酸總量約為17.249 g）江蘇緣生堂；水合茚三酮、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉等（均為分析純）天津市大茂化學試劑廠。

1.2儀器與設備

HC-400Y2粉碎機永康市天祺盛世工貿有限公司；SC-15水浴箱上海比朗儀器有限公司；722型可見分光光度計上海菁華科技儀器有限公司；TD12001分析天平奧豪斯國際貿易（上海）有限公司。

1.3方法

1.3.1樣品處理

將實驗用桑葉茶開封后即用高速粉碎機粉碎至70～300 目，之后混勻密封備用。

1.3.2游離氨基酸與多酚的提取

準確稱取一定量桑葉茶粉末，加入100 mL去離子水配成一定水茶比的料液，在一定浸提溫度條件下浸提一定時間，浸提液冷卻后減壓過濾，將過濾后的浸提液定容至100 mL，并記錄濾液質量。

1.3.3響應面法優化游離氨基酸與多酚的提取工藝

根據Box-Behnken試驗設計原理，結合單因素試驗結果，選取浸提溫度、水茶比和浸提時間3 個影響因素，在單因素試驗的基礎上采用三因素三水平的響應面分析方法，桑葉茶試驗因素與水平參見表1，有17 個試驗點，其中12 個為析因點，5 個為零點，零點共試驗了5 次，以估計誤差［14-18］。

表1　桑葉茶浸提試驗的因素和水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken experimental design

1.3.4桑葉茶主要成分的測定

多酚含量測定方法參見GB/T 21733—2008《茶飲料》；游離氨基酸含量測定方法參見GB/T 8314—2013《茶：游離氨基酸總量的測定》。

氨基酸標準曲線繪制：稱取250 mg谷氨酸純品溶于水中并定容至25 mL，分別移取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL之后再分別加水定容至50 mL，分別吸取這5組谷氨酸標準溶液各1 mL，分別加入0.5 mL pH 6.8的磷酸鹽緩沖液和0.5 mL的2%茚三酮溶液，沸水浴中加熱15 min，冷卻后加水定容至25 mL，在579 nm波長處測其吸光度，用最小二乘法經線性回歸后得到，相關系數R=0.999 8，式中：C為氨基酸質量濃度/（mg/mL）；A為吸光度。

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1浸提溫度對游離氨基酸和多酚提取量的影響

圖 1　浸提溫度對桑葉茶中游離氨基酸和多酚提取量的影響Fig.1　Effect of extraction temperature on the extraction yields of free amino acids and polyphenols from mulberry leaf tea

為考察浸提溫度對游離氨基酸和多酚提取量的影響，分別在50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃條件下對桑葉茶進行了浸提，由圖1可知，在水茶比90∶1（mL/g）、浸提時間20 min的條件下，游離氨基酸提取量在55～60 ℃有明顯的上升，之后隨著溫度上升呈現較為穩定的增長趨勢，并從80 ℃開始提取量基本保持穩定；多酚提取量在70 ℃之前隨溫度升高緩慢增長，從70 ℃開始呈現明顯的增長，并在85 ℃開始，提取量基本保持穩定。游離氨基酸分子質量較小且含量更多，相比多酚更易溶出，而茶多酚主要分布在葉肉組織深層，穩定性好，要較高的溫度才能溶出［19］，故溫度變化對其浸出的影響較大，這與先前學者的研究［20-21］一致。綜合考慮兩者的提取量，浸提溫度選擇85 ℃較為合適。

圖 2　水茶比對桑葉茶中游離氨基酸和多酚提取量的影響Fig.2　Effect of ratio of tea to water on the extraction yields of free amino acids and polyphenols from mulberry leaf tea

2.1.2水茶比對游離氨基酸和多酚提取量的影響為考察水茶比對游離氨基酸和多酚提取量的影響，分別對50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1、

110∶1、130∶1、150∶1（mL/g）水茶比的桑葉茶進行了浸提，如圖2所示，在浸提溫度85 ℃、浸提時間20 min

條件下，隨著水茶比的增大，游離氨基酸的提取量在

50∶1～90∶1之間增加速率較快，并從90∶1（mL/g）開始提取量基本保持穩定；多酚提取量在水茶比50∶1～90∶1

范圍呈現增長，在90∶1之后提取量有些微小的上下浮動，但提取量基本保持穩定。隨水茶比的增加，桑葉中游離氨基酸和多酚提取量上升至最高值之后趨于穩定，這是由于兩種成分浸出完全，增加溶劑并不能起到增加提取量的效果［22］。因此綜合兩種成分的提取量，水茶比選擇90∶1（mL/g）較為合適。

2.1.3浸提時間對游離氨基酸和多酚提取量的影響

圖 3　浸提時間對桑葉茶中游離氨基酸和多酚提取量的影響Fig.3　Effect of extraction time on the extraction yields of free amino acids and polyphenols from mulberry leaf tea

為考察浸提時間對游離氨基酸和多酚提取量的影響，本試驗分別在對應5、10、15、20、25、30、35、45、60 min浸提時間條件下的桑葉茶進行了浸提，如圖3所示，在浸提溫度85 ℃、水茶比90∶1（mL/g）的條件下，隨著浸提時間的延長，桑葉中游離氨基酸提取量在5～15 min間有顯著的增加，15 min之后提取量基本保持穩定；桑葉多酚提取量在10～15 min區間有顯著增加，15～20 min增加趨勢變緩，在20～45 min區間內提取量基本保持穩定，之后隨著浸提時間的延長又有了明顯的下降趨勢。這可能與浸提的原理有關，固-液浸提過程為3步：1）溶劑進入固體內部，溶質溶解；2）溶質從固體內部到表面；3）溶質溶解液從固體表面到溶劑中。游離氨基酸的分子質量較小，較多酚而言能夠更快的溶出，超過一定的時間后，多酚溶出量開始上升，而游離氨基酸則大部分已溶出，延長時間也對游離氨基酸的溶出意義不大［23］。而多酚提取量隨浸提時間延長之后出現下降，是由于多酚已經基本浸提完全，隨時間的延長引起降解、轉化或絡合［24-25］。因此綜合兩種成分的提取量，時間并不是越長越好，選用20 min作為桑葉茶的浸提時間較為合適。

2.2響應面試驗結果

2.2.1響應面試驗設計及結果

表2為Design-Expert中根據Box-Behnken試驗所給出的桑葉茶的試驗設計和試驗結果。

表2　桑葉茶浸提試驗設計與試驗結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2模型的建立及其顯著性檢驗

利用Design-Expert軟件對表2試驗數據進行多元回歸擬合，得到游離氨基酸和多酚提取量對浸提溫度（A）、水茶比（B）和浸提時間（C）的二次多項式回歸模型為：

游離氨基酸提取量/（mg/g）=－4.969 08+0.385 16A+ 0.195 81B－0.058 285C－1.14×10－3AB+6.675×10－4AC+ 5.362 5×10－4BC－1.568 5×10－3A2－5.583 75×10－4B2－1.331×10－3C2

多酚提取量/（mg/g）=－212.061 15+4.551 07A+ 0.339 23B+0.954 33C+7.687 5×10－4AB－7.017 5×10－3AC－1.818 75×10－3BC－0.025 338A2－1.898 31×10－3B2－6.373 25×10－3C2

表3　桑葉茶游離氨基酸浸提回歸模型的方差分析結果Table 3 Analysis of variance for quadratic polynomial model forextraction of free amino acids from mulberry leaf tea

表 4　桑葉茶多酚浸提回歸模型的方差分析結果Table 4 Analysis of variance for quadratic polynomial model forextraction of polyphenols from mulberry leaf

由表3、4可知，游離氨基酸浸提模型的P＜0.000 1，多酚浸提模型的P＜0.000 1，表明回歸模型極顯著；游離氨基酸浸提失擬項P=0.109 5，不顯著，多酚浸提失擬項P=0.085 4，不顯著；游離氨基酸浸提復相關系數R為0.993 0，多酚浸提復相關系數R為0.994 6，說明桑葉茶這兩種有效成分的浸提模型擬合程度良好，試驗誤差小，可以用此模型來分析和預測桑葉茶浸提的工藝結果。

表5　桑葉茶游離氨基酸浸提回歸模型系數的顯著性檢驗結果Taabbllee 55 　RReessuullttss ooff ssiiggnniiffi i ccaannccee tteesstt ffoorr rreeggrreessssiioonn ccooeeffffi i cciieennttss iinn eexxttrraaccttiioonn ooff ffrreeee aammiinnoo aacciiddss ffrroomm mmuullbbeerrrryy lleeaaff tteeaa

由表5回歸模型系數顯著性檢驗結果可知，游離氨基酸模型的一次項、二次項及交互項均顯著。表明各影響因素對于桑葉茶中浸游離氨基酸提取量的影響并不是簡單的線性關系。

表6　桑葉茶多酚浸提回歸模型系數的顯著性檢驗結果TTaabbllee 66 　RReessuullttss ooff ssiiggnniiffi i ccaannccee tteesstt ffoorr rreeggrreessssiioonn ccooeeffffi i cciieennttss iinn extraction of polyphenols from mulberry leaf tea

由表6回歸模型系數顯著性檢驗結果可知，多酚模型的一次項、二次項均極顯著，交互項AC、BC顯著，AB不顯著。表明各影響因素對于桑葉茶中多酚提取量的影響并不是簡單的線性關系。

2.2.3桑葉茶浸提工藝的響應面

當浸提溫度為90 ℃時，由圖4可知，游離氨基酸提取量隨著水茶比的增加而增加，并在水茶比達到85∶1（mL/g）左右提取量基本保持穩定，而隨著浸提時間的延長，游離氨基酸的提取量變化不明顯。隨著水茶比的增加，多酚提取量逐漸增加，并在水茶比達到82∶1左右提取量基本保持穩定，隨著浸提時間的延長，多酚提取量有所增加之后又出現些微下降，且水茶比越高這種趨勢越明顯。等高線的形狀可以反映出交互效應的強弱。從圖4等高線圖可以看出，水茶比相對于浸提時間對游離氨基酸提取量的影響作用更為顯著一些；對于多酚提取量則是在水茶比約82∶1之前，水茶比影響作用較浸提時間顯著，而在水茶比達到約82∶1之后，則浸提時間的影響更為顯著。

圖 4　桑葉茶浸提過程中水茶比和浸提時間交互作用對提取量影響的響應面和等高線Fig.4　Response surface plot and contour plot showing the effect of ratio of water to tea and extraction time and their mutual interaction on the extraction yields of free amino acids and polyphenols from mulberry leaf tea

圖 5　桑葉茶浸提過程中浸提溫度和浸提時間交互作用對提取量影響的響應面和等高線Fig.5　Response surface plot and contour plot of the effect of extraction temperature and time and their mutual interaction on the extraction yields of free amino acids and polyphenols from mulberry leaf tea

當水茶比為90∶1（mL/g）時，由圖5可知，隨著浸提溫度的上升，游離氨基酸的提取量也隨之升高，并在浸提溫度達到約85 ℃之后，游離氨基酸提取量基本保持穩定，而隨著浸提時間的延長，桑葉茶中的游離氨基酸的提取量有些微增加但變化不明顯。隨著浸提溫度的升高，多酚提取量隨之增加，且在浸提溫度達到約80 ℃之后，隨著浸提時間的延長，多酚提取量都有所下降，隨著浸提溫度繼續升高，這種趨勢出現的時間越早且越明顯。從圖5等高線圖可以看出，浸提溫度對游離氨基酸提取量影響作用較浸提時間更為顯著；對于多酚提取量在浸提溫度約85 ℃之前，浸提溫度相對于浸提時間表現更為顯著一些，而在85 ℃之后，兩者對多酚提取量影響的交互性變得顯著。

圖 6　桑葉茶浸提過程中浸提溫度和水茶比交互作用對提取量影響的響應面和等高線Fig.6　Response surface plot and contour plot of the effect of extraction temperature and ratio of water to tea and their mutual interaction on the extraction yields of free amino acids and polyphenols from mulberry leaf tea

當浸提時間為20 min時，由圖6可知，隨著浸提溫度和水茶比的升高和增加，游離氨基酸的提取量增加，隨之浸出完全提取量漸漸趨于穩定。隨著浸提溫度升高多酚提取量增加，在浸提溫度達到約84 ℃，多酚提取量達到相對最大值并保持穩定，至約93 ℃穩定結束，提取量開始略有下降，而在浸提溫度84～93 ℃之間，隨著水茶比的增加，多酚提取量增加，其余溫度區間隨著水茶比的增加多酚提取量變化不明顯。由圖6等高線圖可知，浸提溫度和水茶比對游離氨基酸的提取量都有顯著的影響作用，交互作用明顯；對于多酚提取量，浸提溫度有著較為顯著的影響作用。

比較上面的3組圖可知，浸提溫度和水茶比對桑葉茶中的游離氨基酸提取量的影響較為顯著，表現為曲線較陡，浸提時間影響作用一般顯著，表現為曲線相對較平緩，且隨其數值的增加或減少，響應值的變化較小。浸提溫度對桑葉茶中的多酚提取量的影響最為顯著，其次是水茶比，浸提溫度次之。

根據軟件Design-Expert對桑葉茶中的游離氨基酸和多酚的模型進行計算，將這兩個響應值的重要性設定為同等重要，并考慮到不同條件下的能耗問題，選取模型中的最優浸提條件，得出最佳浸提溫度88.62 ℃、水茶比86.83∶1（mL/g）、浸提時間16.06 min，在此條件下游離氨基酸提取量可達到21.28 mg/g，多酚提取量可達到14.48 mg/g。

為檢驗響應面方法所得結果的可靠性，采用上述優化浸提條件對桑葉茶進行浸提，考慮到實際操作的便利，將浸提工藝參數修正為：浸提溫度89 ℃、水茶比87∶1（mL/g）、浸提時間16 min。在此條件下浸提3 次，實際測得游離氨基酸提取量為21.46 mg/g，多酚提取量為14.32 mg/g，與理論預測值相比，游離氨基酸的相對誤差為0.85%，茶多酚的誤差率為1.10%。因此，基于響應面所得的優化浸提工藝參數準確可靠，具有實用價值。

3　結 論

利用響應面法，通過二次回歸設計得到桑葉茶游離氨基酸和多酚與浸提溫度、水茶比、浸提時間關系的回歸模型，從模型的響應面及其等高線對影響桑葉茶游離氨基酸和多酚提取量的3 個關鍵因素及其相互作用進行了探討。并得出最佳條件為浸提溫度89 ℃、水茶比87∶1（mL/g）、浸提時間16 min，該條件下得兩種成分的提取量分別是：游離氨基酸21.46 mg/g，多酚14.32 mg/g。

因此選取兩種主要成分作為響應值，通過響應面法對桑葉茶浸提工藝進行研究優化，充分考慮到不同操作條件之間的相互影響作用，以及使得不同成分提取量的最大化所對應的操作條件的差異，建立合理有效的模型進行系統的分析優化，減少了針對單個因素分別實驗的盲目性，從而在有效的模型中得到最優浸提條件，并對模型得出的最優條件下的預測值進行驗證，充分證明了模型結果的準確性，為桑葉茶浸提工藝的研究提供了參考。

［1］王芳， 勵建榮. 桑葉的化學成分、生理功能及應用研究進展［J］. 食品科學， 2005， 26（增刊1）: 111-117.

［2］白旭華. 桑葉的營養與藥用價值及其開發應用［J］. 云南熱作科技，2001， 24（2）: 37-38.

［3］毛清黎. 茶葉氨基酸的研究進展［J］. 氨基酸雜志， 1989（4）: 16-20.

［4］丁雙華. 桑葉多酚類物質分離提取及活性的初步研究［D］. 杭州: 浙江工商大學， 2011.

［5］楊賢強， 曹明富， 沈生榮， 等. 茶多酚生物學活性的研究［J］. 茶葉科學， 1993， 13（1）: 51-59.

［6］黃靜， 李學剛， 陳新， 等. 桑葉不同溶劑萃取物抗氧化活性研究［J］.亞太傳統醫藥， 2012（3）: 31-32.

［7］王燦， 左艇， 王琳琳. 桑葉黃酮抗皮膚衰老實驗研究［J］. 中國醫藥導報， 2011（3）: 30-31.

［8］KIM S Y， GAO J J， KANG H K. Two flavonoids from the leaves of Morus alba induce differentiation of the human promyelocytic leukemia （HL-60） cell line［J］. Biological and Pharmaceutical Bulletin，2000， 23: 451-455.

［9］安徽農學院. 茶葉生物化學［M］. 北京: 農業出版社， 1980: 51 .

［10］ 張元澤， 鄭劍. 桑葉飲料的工藝研究［J］. 安徽農學通報， 2012，18（23）: 151-152.

［11］ 龔德華. 每小時產6 000 瓶桑葉茶飲料生產線的工廠設計［D］. 南昌:南昌大學， 2012.

［12］ 楊文雄， 高彥祥. 響應面法及其在食品工業中的應用［J］. 中國食品添加劑， 2005（2）: 68-71.

［13］ 慕運動. 響應面方法及其在食品工業中的應用［J］. 鄭州工程學院學報， 2001， 22（3）: 91-94.

［14］ 蘇楠， 何羨霞， 馮青， 等. 響應面分析法優化桑葉中1-脫氧野尻霉素的稀酸乙醇浸提工藝［J］. 中國實驗方劑學雜志， 2014， 20（3）: 13-16. ［15］ 吳華勇， 黃贛輝， 顧振宇， 等. 響應面法優化竹葉總黃酮的提取工藝研究［J］. 食品科學， 2008， 29（11）: 196-200.

［16］ WANI A A， KAUR D， AHMED I， et al. Extraction optimization of watermelon seed protein using response surface methodology［J］. LWT-Food Science and Technology， 2008， 41（8）: 1514-1520.

［17］ 國蓉， 李劍君， 國亮， 等. 采用響應面法優化甘草飲片中甘草酸的超聲提取工藝［J］. 西北農林科技大學學報: 自然科學版， 2006， 34（9）: 187-192.

［18］ SHAO Ping， SUN Peilong， YING Yanjie. Response surface optimization of wheat germ oil yield by supercritical carbon dioxide extraction［J］. Food and Bioproducts Processing， 2008， 86（3）: 227-231.

［19］ 黃椿鑒， 傅虬聲， 李志達， 等. 烏龍茶在浸提中溫度和時間的最佳決策研究［J］. 農業工程學報， 1995， 11（4）: 180-184.

［20］ 唐臣朝. 淺析高級綠茶的沖泡水溫標準［J］. 城市技術監督， 1991（3）: 32-33.

［21］ 曾敏， 劉偉， 龔正禮. 用鮮葉加工低咖啡因速溶綠茶的工藝研究［J］.食品工業科技， 2014， 35（16）: 286-293.

［22］ 陳小紅. 浸提與濃縮工藝對綠茶汁品質影響的研究［D］. 福州: 福建農林大學， 2013.

［23］ 劉偉. 用鮮葉加工低咖啡因速溶茶的工藝研究［D］. 重慶: 西南大學， 2013.

［24］ 閻守和. 速溶茶生物化學［M］. 北京: 北京大學出版社， 1990: 41-42.

［25］ 宛曉春. 茶葉生物化學［M］. 北京: 中國農業出版社， 2008: 305-308.

Optimization of the Extraction Process of Free Amino Acids and Polyphenols from Mulberry Leaf Tea by Response Surface Methodology

WANG Xingtian， LI Guishui*， CHENG Lijun， LI Yi， TAO Siyi， ZHANG Bing
（Tianjin Key Laboratory of Integrated Design and On-line Monitoring for Light Industry and Food Machinery and Equipment，College of Mechanical Engineering， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin300222， China）

In order to achieve good taste and high nutritional value for mulberry leaf tea beverage， the extraction simultaneous process of free amino acids and polyphenols from mulberry leaf tea using water as the extractant was optimized by response surface methodology. The results showed that the optimal extraction temperature， water/tea ratio and extraction time were 89 ℃， 87:1 （mL/g）， and 16 min， respectively. Under these conditions， the extraction yields of free amino acids and polyphenosl were experimentally determined to be 21.46 and 14.32 mg/g， respectively， which were both close to the predicted values. These results indicate the quadratic polynomial mathematical model built by Design-Expert software was accurate and feasible and the optimized extraction process was stable and reliable. This study can provide a reference for the development of mulberry leaf tea beverage.

mulberry leaf tea； response surfa ce methodology （RSM）； polyphenols； free amino acids； extraction

TS272

A

1002-6630（2015）24-0083-06

10.7506/spkx1002-6630-201524014

2015-04-26

王星天（1991—），男，碩士研究生，研究方向為非均相分離。E-mail：wangxingtian525@126.com*

李桂水（1965—），男，副教授，碩士，研究方向為非均相分離。E-mail：liguishui@tust.edu.cn