石榴花精油成分分析及清除自由基能力評價

賈秀穩，張立華，李先如，孟 健，艾征東，李欣宇

（棗莊學院生命科學學院，山東 棗莊　277160）

石榴花精油成分分析及清除自由基能力評價

賈秀穩，張立華*，李先如，孟 健，艾征東，李欣宇

（棗莊學院生命科學學院，山東 棗莊277160）

采用氣相色譜-質譜聯用技術分析石榴花精油的化學成分，通過對2，2-聯氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（2，2'-amino-di （2-ethyl -benzothiazoline sulphonic acid-6）ammonium salt，ABTS）及1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1 dipheny1-2 picryl-hydrazyl，DPPH）自由基的清除作用評價其抗氧化能力。結果表明，從石榴花精油中共分離出52 個質譜峰，鑒定出32 種成分，其中有9 種烷烴類化合物（其中有5 種環烷烴和4 種直鏈烷烴）、7 種萜烯類化合物、6 種酯類化合物、4 種芳香族醇類化合物、酮類和醛類化合物各2 種、生物堿類和磺酸鹽類化合物各1 種。對ABTS+·和DPPH自由基清除力分別為0.029 mg/mg VC當量和0.01 mg/mg VC當量。表明石榴花精油中含有多種有應用價值的化學成分，是一種具有開發利用價值的天然資源。

石榴花；精油；化學成分；抗氧化

植物精油是植物體內產生的一種具有揮發性的次生代謝物，由分子質量較小的簡單化合物組合而成，可隨水蒸氣蒸餾，是一類有氣味的揮發性油狀液體物質，植物精油又稱為液體黃金［1］，商業上稱芳香油，化學和醫藥學上稱揮發油［2］。主要是從植物的根、莖、葉、花或果實等器官中獲得［3］，經水蒸氣蒸餾法、壓榨法、吸收法、溶劑萃取法和超臨界二氧化碳萃取法等方法制得［4］。因其較高的生物活性可以廣泛應用到醫藥、食品、化妝品等多個方面，所以對植物精油的開發利用一直備受關注，可謂一個經久不息的研究熱點。石榴花是石榴科植物石榴（Punica granatum L.）的花，含有多酚類、黃酮類、三萜類等多種成分［5］，收載于衛生部《藥品標準（維吾爾藥分冊）》中，具有止癢、止瀉、止血等多種功效，主要用于治療中耳炎和糖尿病等癥［6］。現代研究［7］表明，石榴花具有降血脂、降血壓的作用。由于石榴花花期長，開花量大，大部分花不能正常結果而自然脫落，因此石榴花的資源豐富，極具開發價值［8］。然而對石榴活性物質的研究和開發多集中于石榴葉、果皮和籽，對石榴花的研究才剛剛起步，相關報道較少，對石榴花精油的有關研究更是鮮有報道。本實驗采用水蒸餾法從石榴花中提取精油并用氣相色譜-串聯質譜（gas chromatography-mass-mass spectrometer，GC-MS/MS）聯用儀分析研究石榴花精油的化學成分，利用2，2-聯氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（2，2'-amino-di （2-ethyl -benzothiazoline sulphonic acid-6）ammonium salt，ABTS）和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1 dipheny1-2 picryl-hydrazyl，DPPH）自由基清除法來評價石榴花精油的抗氧化活性，為石榴花資源的開發利用提供科學依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

石榴花樣品（品種為崗榴）于2014年6月采自棗莊學院校園，由棗莊學院生命科學學院植物學教研室李思健副教授鑒定為石榴科石榴屬植物石榴（Punica granatum L.）的花，樣品于65 ℃恒溫烘干，放置于冰箱貯存備用。

ABTS、DPPH美國Sigma公司；無水硫酸鈉、無水乙醚、甲醇等均為國產分析純，實驗用水為去離子水。

1.2儀器與設備

7000B GC-MS聯用儀美國Agilent公司；UV2000紫外-可見分光光度計尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1石榴花精油的提取

采用水蒸氣蒸餾法提取石榴花精油［9］，并略作調整。具體步驟：將石榴花用研缽研碎后稱量40.00 g置于1 000 mL圓底燒瓶中，加水400 mL，用揮發油蒸餾管蒸餾提取6 h。重復上述步驟提取10 次，合并10 次的提取產物，得到具有濃郁香味的淡黃色油狀物，取出一部分用乙醚溶解并加入少量無水硫酸鈉脫水處理，再用于GC-M/MS測試。

1.3.2GC-MS/MS分析

參照文獻［10］的方法并加以改進，具體操作條件：高純氦氣為載氣，體積流量1.0 mL/min，分流比為20∶1；進樣口溫度280 ℃；進樣量0.5 μL，色譜柱初始溫度60 ℃，以5 ℃/min升至270 ℃，保持10 min。電子電離源；電子能量70 eV；質量掃描范圍m/z 350～450；MS數據庫NIST 11。

1.3.3石榴花精油對ABTS+·的清除作用測定

采用文獻［11］的方法略做改進。7 mmol/L溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀混合，置于暗處12～16 h，用甲醇將ABTS+·溶液稀釋至在波長732 nm吸光度0.70±0.02。將提取的石榴花精油樣品用甲醇配制成質量濃度為1.0 mg/mL的母液，按一定量與2 mL ABTS+·溶液混合，并用水補充反應體系至3 mL，搖勻后靜置6 min后，在波長732 nm處測吸光度。每份樣品平行操作3 次。清除率按公式（1）計算。

式中：A0為2 mL ABTS+·溶液與1 mL甲醇混合后的吸光度；A樣為2 mL ABTS+·溶液與1 mL樣品混合后的吸光度。

繪制不同用量條件下清除率曲線，并求出清除率為50%時的用量，即半抑制濃度（the half maximal inhibitory concentration，IC50）。以質量濃度0.02 mg/mL的VC為參照，按上述步驟操作并求出IC50，通過比較二者的IC50值計算出樣品相當于VC用量，即VC當量（mg/mg VC）。

1.3.4石榴花精油對DPPH自由基的清除作用測定

參照文獻［12］的方法并加以改進，操作方法：向波長517 nm處吸光度為1.5的DPPH-甲醇溶液中加入一定量的試樣（空白對照用等量重蒸水代替），總體積用蒸餾水補充至3 mL用力搖勻后于室溫條件下放置30 min，再用光徑1 cm比色皿中測定DPPH混合溶液在波長517 nm處吸光度（A517 nm），用2.5 mL甲醇與0.5 mL試樣混合液調儀器零點，以扣除試樣本身顏色的影響。自由基清除率按公式（2）計算：

DPPH自由基清除率/%=（A′0－A′樣）/A′0×100 （2）

式中：A′0為2 mL DPPH溶液與1 mL甲醇混合后的吸光度；A′樣為2 mL DPPH溶液與1 mL樣品混合后的吸光度。

繪制不同用量條件下清除率曲線，并求出IC50。以質量濃度0.02 mg/mL的VC為參照，按上述步驟操作并求出IC50，通過比較二者的IC50值計算出樣品的VC當量（mg/mg VC）。

2　結果與分析

2.1石榴花精油的化學成分

圖 1 石榴花精油GC-MS/MS總離子流色譜圖Fig.1　GC-MS/MS total ion chromatogram of essential oil from pomegranate fl ower

如圖1所示，共分離出52 個質譜峰，經從NIST 11數據庫檢索，并結合參考相關質譜文獻［13-14］，初步判斷出其中32 種化合物成分，鑒定結果如表1所示。其中以含C、H及O的化合物為主，也有少量的物質含有N、S等其他原子。包括9 種烷烴類化合物（其中有5 種環烷烴和4 種直鏈烷烴）、7 種萜烯類化合物、6 種酯類化合物、4 種芳香族醇類化合物、2 種酮類化合物、2 種醛類化合物、1 種生物堿類化合物及1 種磺酸鹽類化合物。石榴花精油獨特的香味即由上述物質呈現。其中生物活性比較高的成分有二十五烷、二十四烷、α-蓽澄茄油烯、欖香烯、石竹烯、愈創木烯、3-糖醛等［15］。進一步分析發現，石榴花精油中有C15H24（7 種）、C15H22（3 種）和C15H26O （3 種）3 類同分異構體。C15H22的同分異構體有2 種是倍半萜烯類化合物，一個是烷烴類；C15H26O的3 種同分異構體則全是醇類化合物；C15H24的同分異構體最多，共有7 種，且保留時間集中在17.048 0～21.310 8 min范圍內，這7 種化合物有5 種是倍半萜烯類化合物，另外2 種是環烷烴類化合物。通過峰面積可以判斷倍半萜烯類化合物是石榴花精油香氣的主要成分。

表1　石榴花精油化學成分TTaabbllee 11 　CChheemmiiccaall ccoonnsstituents of essential oil from pomegranate fl ower

2.2石榴花精油對ABTS+·的清除作用

ABTS+·是一種呈藍綠色相對穩定的水溶性自由基，抗氧化劑與ABTS+·反應后使其溶液褪色，特征吸光度降低。在該反應體系中，溶液褪色越明顯則表明所檢測物質的總抗氧化能力越強［16］，在波長732 nm處測定其吸光度即可測定并計算出樣品的ABTS+·清除能力。如圖2所示，當清除率為50%時，石榴花精油和VC的用量分別是348.8 μL和487.8 μL，石榴花精油相對于VC的當量數為0.029 mg/mg。表明石榴花精油具有較弱的ABTS+·清除能力。

圖2　石榴花精油對ABBTTSS+·的清除作用Fig.2　ABTS+· free radical scavenging-capacity of essential oil of pomegranate fl ower

2.3石榴花精油對DPPH自由基的清除作用

DPPH是一種人工合成的有機自由基，其結構中含有3 個苯環，1 個氮原子上有1 個孤對電子，常用來評估抗氧化物的供氫能力，它在有機溶劑中非常穩定，呈紫色，在波長517 nm處有強吸收［17］。當反應體系中存在抗氧化劑時，抗氧化劑提供氫原子和電子給DPPH自由基，使其生成無色產物，導致溶液的特征吸收峰下降，吸光度變小。在此反應中，體系顏色變得越淺表明所檢測物質的抗氧化能力越強［18］。因此，可通過測定吸光度的變化來評價樣品對DPPH自由基的清除效果。如圖3所示，當清除率為50%時，石榴花精油和VC的用量分別是480.6 μL和483.1 μL，石榴花精油相對于VC的當量數為0.01 mg/mg。表明石榴花精油具有較弱的清除DPPH自由基能力。

圖3　 石榴花精油對DPPH自由基的清除作用Fig.3　DPPH free radical scavenging-capacity of essential oil of pomegranate fl ower

3　討 論

植物類精油按化學結構可分為脂肪族、芳香族和萜類3 大類化合物以及它們的含氧衍生物如醇、醛、酮、酸、醚、酯、內酯等，此外還有含氮和含硫的化合物［19-20］。本實驗用GC-MS/MS法分析了石榴花精油的化學成分，并鑒定了其中32 種化合物成分，這些化合物以含C、H 和O元素為主，少數還含有N、S等雜原子的。含量較多的化合物為酯類、烷烴類和萜類。本實驗鑒定的32 種化合物中，相對分子質量最大的化合物是1，54二溴-五十四烷，相對分子質量最小的化合物是3-糖醛。陳志偉等［10］的研究結果與本實驗有些差別，從石榴花揮發油中分離鑒定出23 種化合物，主要成分為醛類和脂肪酸，且所有化合物中都不含氮、硫等其他雜原子。鑒定出的23 種化合物中，相對分子質量最小化合物為3-甲基2-丁烯-1-醇、相對分子質量最大化合物為二十五烷。分析其產生較大差別的原因，可能是本實驗所用的GC-MS/MS二級質譜測定增強了結構解析和定性能力，提高了特異性離子靈敏度；也可能石榴花的產地和品種的不同導致石榴花精油化學成分有所差異。

在本實驗所鑒定的主要成分中，欖香烯是一種易通過血腦屏障的國家二級抗腫瘤新藥［21］。在臨床廣泛用于惡性漿膜腔積液、肺癌、消化道腫瘤、腦瘤以及其他淺表性腫瘤的治療［22］。石竹烯可用于調配丁香、胡椒、肉豆蔻、柑橘、藥草等食用香精，也可用于合成其他香料［23］。因此，石榴花精油中化學成分不僅種類多，而且有些成分應用價值較高。

石榴花精油對ABTS+·和DPPH自由基清除力分別為0.029 mg/mg VC和0.01 mg/mg VC當量，即其對2 種清除力分別是VC的2.9%和1%。有研究［24-25］表明，植物精油的抗氧化活性主要依賴于其中酚類物質的含量，含量越高抗氧化活性越強，相反，抗氧化活性就弱。本實驗檢測出石榴花精油的成分主要是烷烴類、萜烯類、酯類、芳香族醇類、酮類、醛類、生物堿類和磺酸鹽類 化合物。這些物質遇到ABTS+·、DPPH自由基時，不容易提供氫而發生反應，所以表現比較弱的自由基清除力。而本實驗在石榴花精油中未檢出酚類物質，這可能就是石榴花精油抗氧化活性弱的原因。陳志偉等［10］雖然在石榴花揮發油中檢測出酚類物質，但其含量僅為1.36%。

綜上所述，石榴花精油化學成分較豐富，且具有較高的應用價值，可作為保健藥品資源。

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Analysis of the Chemical Constituents of Essential Oil from Pomegranate Flower and Evaluation of Its Free Radical Scavenging Ability

JIA Xiuwen， ZHANG Lihua*， LI Xianru， MENG Jian， AI Zhengdong， LI Xinyu
（College of Life Sciences， Zaozhuang University， Zaozhuang277160， China）

Abstracts: Gas chromatography-mass spectrometer （GC-MS） was used to analyze the chemical components in essential oil of pomegranate fl ower. The free radical scavenging ability of the oil was assessed by using 1，1 dipheny1-2 picryl-hydrazyl （DPPH） system and 2，2'-amino-di （2-ethyl -benzothiazoline sulphonic acid-6） ammonium salt （ABTS+·） system. The results showed that 52 peaks were detected from the pomegranate fl ower oil and 32 compounds were identifi ed， including 9 alkanes （5 naphthenic hydrocarbons and 4 straight-chain alkanes）， 7 terpenes， 6 esters， 4 alcohols， 2 ketones and aldehydes，1 alkaloid and sulfonate. The free radical scavenging capacity of the oil against ABTS+· and DPPH free radicals were 0.029 and 0.01 mg/mg vitamin C （VC） equivalent， respectively. These results indicate that pomegranate fl ower essential oil contains a variety of chemical constituents with potential applications as a valuable natural resource.

pomegranate fl ower； essential oil； chemical constituents； antioxidant activity

R962

A

1002-6630（2015）24-0152-04

10.7506/spkx1002-6630-201524027

2015-03-31

山東省自然科學基金項目（ZR2013BL018）；棗莊學院大學生創新訓練項目（2014018）

賈秀穩（1991—），女，本科生，研究方向為藥用植物資源開發。E-mail：2455818660@qq.com

張立華（1969—），男，教授，博士，研究方向為植物資源開發及采后生理。E-mail：chinazhanglh@163.com