酪蛋白水解物中ACE抑制肽分離及氨基酸序列分析

胡志和，夏 磊，孫振剛，武文起，馮永強，薛 璐，劉蓄瑾，賈 瑩

（1.天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津　300134；2.天津市食品生物技術重點實驗室，天津　300134；3.天津海河乳業有限公司，天津　300402）

酪蛋白水解物中ACE抑制肽分離及氨基酸序列分析

胡志和1，2，夏 磊1，孫振剛3，武文起3，馮永強3，薛 璐1，2，劉蓄瑾1，賈 瑩1

（1.天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津300134；
2.天津市食品生物技術重點實驗室，天津300134；3.天津海河乳業有限公司，天津300402）

以牛乳酪蛋白為底物，先經胃蛋白酶水解，再經胰蛋白酶水解，從水解物中分離獲得血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽并確定其氨基酸序列。酪蛋白的雙酶水解物經超濾和葡聚糖凝膠色譜分離，分離得到3 個組分，收集高ACE活性抑制效果組分Ⅱ和Ⅲ。采用離子色譜法分析水解片段的氨基酸組成，液相色譜-質譜法分析水解片段的氨基酸序列，采用固相合成法制備獲得的短肽片段，用分光光度法檢測ACE活性抑制效果。結果表明，組分Ⅱ包含纈氨酸、絲氨酸、脯氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸，共8 種氨基酸，組分Ⅲ包含痕量的絲氨酸和酪氨酸；將組分Ⅱ和Ⅲ經液相色譜-質譜分析，獲得8 個片段，其中，αs2-f （56～57）∶YS、αs2-f（98～107）∶YQKFPQYLQY和κ-f（52～61）∶INNQFLPYPY具有ACE活性抑制作用，其IC50值分別為11.89、11.75 μg/mL和421 μg/mL。

牛乳酪蛋白；胃蛋白酶；胰蛋白酶；血管緊張素轉化酶；抑制肽

血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是一種多功能酶，在體內的升壓系統（腎素-血管緊張素系統）和降壓系統（激肽-激肽釋放酶系統）中起著重要的調節作用［1-3］。ACE抑制劑（ACE inhibitor，ACEI）也是心血管和高血壓疾病治療使用較多的藥物［4］。然而，包括ACEI在內的合成的降壓藥物，對人體均有副作用［5-7］，因此，人們將研究的重點轉移到天然抗高血壓產物的開發。近年來，大量的科學研究發現，在食物蛋白中存在多種生物活性片段，可通過蛋白酶水解釋放出來，其中包括ACE抑制肽。目前，研究人員分別從乳蛋白［8-15］、墨魚蛋白［16］、蜥魚蛋白［17］、蝦蛋白［18］、蠶蛹蛋白［19］、雞蛋清蛋白［20］、鯵蛋白［21］、魚類蛋白［22］、花生蛋白［23］、大豆蛋白［24-25］、螺旋藻蛋白［26］等蛋白的酶解物中分離出ACE抑制肽，并確定了肽的氨基酸序列。

本研究以牛乳酪蛋白為原料，先經胃蛋白酶水解，再用胰蛋白酶水解，從水解產物中分離純化具有ACE活性抑制作用的肽片段，并對其氨基酸序列進行分析。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

酪蛋白天津海河乳業有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-hisleu hydrate，HHL）（H1635-25 mg）、ACE（A6778-0.25UN）、18 種氨基酸的標準品美國Sigma公司；鹽酸、氯化鈉、NaAC（均為分析純）天津市化學試劑批發公司；磷酸二氫鈉（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）、乙腈（色譜級）天津市贏達稀貴化學試劑廠；四硼酸鈉、氫氧化鈉、氫氧化鈉、乙酸乙酯（均為分析純）天津市凱通化學試劑有限公司；甲醇（高效液相色譜級）、HAC（分析純）天津市科密歐化學試劑有限公司；三氟乙酸（tallow fatty acid，TFA）天津南開允公合成技術有限公司；Sephadex G-15固體粉末Pharmacia公司。

1.2儀器與設備

L535-1低速離心機長沙湘儀離心機儀器有限公司；1.0 cm×100 cm層析柱、CXG-1電腦恒溫層析柜、HD-3紫外檢測儀、DBS-100電腦全自動部份收集器、HD-A電腦采集器上海滬西分析儀器廠有限公司；pH儀德國賽得利斯北京有限公司；DH-101型電熱恒溫鼓風干燥箱天津市中環實驗電爐有限公司；KDC-160HR高速冷凍離心機科大創新股份有限公司；UV-2100型分光光度計美國Unico公司；Dionex ICS-3000型金電極電化學檢測器、AminoPac PA-10型分析柱（2 mm×250 mm）、AminoPac PA-10型預柱（2 mm×50 mm）、Amino Acids電位波形（pH，Ag，AgCl Reference）、LTQ XL型色譜-質譜檢測儀器、LCMC/MC sequent軟件美國賽默飛世爾科技公司。

1.3方法

1.3.1酪蛋白的雙酶水解物的制備

采用楊銘等［27］的方法制備水解產物，并進行改良。配制質量分數7%酪蛋白的水溶液，用濃鹽酸調節溶液的pH值至3.0，加熱并保持溫度37 ℃，按照酶與底物比為1∶100（g/g）加入胃蛋白酶水解3 h后用沸水浴滅酶10 min。水解液冷卻至48 ℃，用5 mol/L NaOH溶液調pH 7.7，加入胰蛋白酶，酶與底物比為1∶500（g/g），水解3 h后，用沸水浴滅酶10 min。冷卻至室溫，調節pH值至7.0。在4 000 r/min條件下離心15 min。上清液用截留分子質量為6 kD的中空纖維膜組件在0.05～0.10 MPa壓力范圍內循環超濾，獲得分子質量小于6 kD的溶液，經冷凍干燥后待用。

用洗脫緩沖溶液（濃度0.02 mol/L、pH 6.8的磷酸鹽緩沖液）將冷凍干燥粉末配制成質量濃度為100 mg/mL溶液，通過Sephadex G-15進行分離。分離條件：上樣量3 mL，紫外檢測波長280 nm，洗脫速率0.4 mL/min，按7.5 min/管進行收集，獲得3 個分離組分。采用分光光度法（HHL方法［28］）檢測酪蛋白雙酶水解物、水解物經截留分子質量6 kD超濾膜超濾的透出物和3 個組分的ACE抑制效果的IC50值，雙酶水解物IC50值為560 μg/mL，超濾透出物IC50值為250 μg/mL，組分Ⅰ為123.41 μg/mL，組分Ⅱ為66.67 μg/mL，組分Ⅲ為64.29 μg/mL［27］。按公式（1）計算ACE抑制率。

式中：A為反應中ACE抑制劑與ACE同時存在的吸光度；B為反應中不加抑制劑的吸光度，即對照；C為ACE 和HHL空白反應的吸光度，即空白。

1.3.2水解片段的氨基酸序列分析

將ACE活性抑制效果較好的組分Ⅱ和Ⅲ中的片段進行分析。

1.3.2.1氨基酸組成的化學檢測

1）樣品處理：分別稱取大約1 mg的組分Ⅱ和組分Ⅲ于水解管中，加入1 mL 6 mol/L鹽酸溶液，充入高純氮氣，在充氣狀態下擰緊螺絲蓋，放在（110±1） ℃的恒溫干燥箱內，水解24 h之后取出并進行冷凍干燥，待使用時再復溶至1 mL。

從復溶的溶液中取出200 μL樣品溶液，稀釋至4 mL，用IC-C18固相萃取小柱串聯，并以0.22 μm的尼龍針筒過濾器過濾純化，收集1 mL濾出液，待上樣。其中，IC-C18固相萃取小柱串聯提前經過5 mL甲醇和10 mL純水活化、洗滌。

2）標準品：5 μmol/L的18 種氨基酸標準品。

3）試劑配制：250 mmol/L NaOH溶液、1 mol/L NaAC溶液、0.1 mol/L HAC溶液。

4）檢測條件：柱溫30 ℃；流速0.25 mL/min；淋洗液A：純水（＞18.2 MΩ），B：250 mmol/L NaOH溶液，C：1 mol/L NaAC溶液，D：0.1 mol/L HAC溶液。

5）洗脫時間及梯度，見表1。

表1　氨基酸化學檢測的洗脫梯度Taabbllee 11 　　EElluuttiioonn ggrraaddiieenntt ffoorr cchheemmiiccaall ddeetteeccttiioonn ooff aammiinnoo aacciiddss

1.3.2.2氨基酸序列分析［27］

采用LTQ XL型色譜-質譜檢測儀器對組分Ⅱ和組分Ⅲ所含片段的氨基酸序列進行檢測，用LC-MC/MC sequent軟件進行分析。

儀器運行條件：離子源NSI；離子源溫度260 ℃；毛細管電壓3.5 kV；脫溶劑氣溫度260 ℃；脫溶劑氣流量20 unit/min；檢測器電壓200 V。

液相色譜分析條件：流動相A：H2O-0.1% TFA；流動相B：乙腈-0.1% TFA；流速200 μL/min（分流后調節為2 μL/min）；進樣量10 μL（冷凍干燥后粉末以5% B液復溶）；進樣方式：自動進樣；洗脫時間和梯度：00～20 min時，B從5%～35%；20～40 min時，B從35%～95%。

1.3.3氨基酸片段的ACE活性抑制效果檢測

經方法1.3.2.2節分析檢測，獲得的短肽片段，采用固相合成法制備，純度大于95%。合成產物由上海楚肽生物科技有限公司制備。

ACE活性抑制效果體外檢測采用HHL方法［28］，確定水解物主要功效成分。

1.4數據處理

氨基酸序列分析采用LC-MC/MC sequent軟件，數據處理采用Excel軟件。

2　　結果與分析

2.1組分Ⅱ和組分Ⅲ中氨基酸組成分析

按照方法1.3.2.1節對水解產物的分離組分Ⅱ和組分Ⅲ的氨基酸組成進行分析。由圖1及表2～4可知，對比18 種氨基酸標準品的洗脫圖譜和出峰時間，組分Ⅱ包含纈氨酸、絲氨酸、脯氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸，共8 種氨基酸；對比18 種氨基酸標準品的洗脫圖譜和出峰時間，組分Ⅲ包含痕量的絲氨酸和酪氨酸。

圖 1　　氨基酸標準品（A）、組分Ⅱ（B）、組分Ⅲ（C）的洗脫圖譜Fig.1　　Elution profi les of mixed amino acid standards （A） and components Ⅱ （B） and Ⅲ （C）

表2　　氨基酸標準品Table 2　　Retention times of amino acid standards

表3　組分Ⅱ中氨基酸Taabbllee 33 　　RReetteennttiioonn ttiimmeess ooff aammiinnoo aacciiddss iinn ccoommppoonneenntt Ⅱ

表 4　組分Ⅲ中氨基酸Taabbllee 44 　　RReetteennttiioonn ttiimmeess ooff aammiinnoo aacciiddss iinn ccoommppoonneenntt Ⅲ

2.2組分Ⅱ和組分Ⅲ中肽片段氨基酸序列分析

2.2.1組分Ⅱ中片段的氨基酸序列1

圖 2　組分Ⅱ與α1-酪蛋白（AA）　　、αss22-酪蛋白（BB）　　、β-酪蛋白（CC）、κ-酪蛋白（D）的氨基酸序列匹配圖Fig.2　Matching profi les of amino acid sequences between component Ⅱ and α1-casein， αs2-casein， β-casein or κ-casein

表 5 組分Ⅱ與α1-酪蛋白的氨基酸序列匹配數據TTaabbllee 55 　　MMaattcchhiinngg ddaattaa ooff aammiinnoo aacciidd sseeqquueenncceess bbeettwweeeenn componneenntt Ⅱ aanndd α-caasseeiinn

表6　組分Ⅱ與αss22-酪蛋白的氨基酸序列匹配數據TTaabbllee 66 　　MMaattcchhiinngg ddaattaa ooff aammiinnoo aacciidd sseeqquueenncceess bbeettwweeeenn componneenntt Ⅱ aanndd αss22-caasseeiinn

表 7 組分Ⅱ與β-酪蛋白的氨基酸序列匹配數據TTaabbllee 77 　　MMaattcchhiinngg ddaattaa ooff aammiinnoo aacciidd sseeqquueenncceess bbeettwweeeenn componneenntt Ⅱ aanndd β-caasseeiinn

表 8　組分Ⅱ與κ-酪蛋白的氨基酸序列匹配數據TTaabbllee 88 　　MMaattcchhiinngg ddaattaa ooff aammiinnoo aacciidd sseeqquueenncceess bbeettwweeeenn componneenntt Ⅱ aanndd κ-caasseeiinn

組分Ⅱ在4 種酪蛋白（α1、α2、β、κ）中都有匹配的肽段，結果見圖2。分析軟件的導出數據見表5～8。圖2A中標示的深色部分代表了氨基酸序列匹配度為“極可信”，所以在實驗結果中，只選取深色部分的氨基酸序列。表5是軟件檢測導出的“極可信”部分的數據。其中，“Q6（脫酰胺基）”6號位置的Q（Gln，谷氨酰胺）有脫氨基現象；“相關系數”是搜庫軟件中打分相關系數，作為篩選條件參比；“對比打分”表示搜庫對比打分；“價態”代表帶H的個數，有1、2、3價；“質荷比”代表價態的分子質量；“分子質量”表示肽段的分子質量。篩選條件：當相關系數大于1.9時，價態為1；當相關系數大于2.2時，價態為2；當相關系數大于3.75時，價態為3；結果便有極高的可信度。因此，結合圖2A和表5分析可知，組分Ⅱ在α1-酪蛋白中的匹配的氨基酸序列有3 段，分別是：LGYLEQLLR、FVAPFPEVFGK和YVPLGTQYTDAPSF。綜合分析圖2B和表6可知，組分Ⅱ在α2-酪蛋白中的極可信氨基酸序列是YQKFPQYLQY。綜合分析圖2C和表7，組分Ⅱ在β-酪蛋白中的極可信的氨基酸序列是PVVVPPFLQPEVM。根據圖2D和表8分析可知，組分Ⅱ在κ-酪蛋白中的極可信匹配的氨基酸序列有2 段，分別為：SRYPSYGLNYYQQKPV 和INNQFLPYPY。

2.2.2組分Ⅲ的氨基酸序列

根據2.1節的結果，可以很明顯得知組分Ⅲ的氨基酸序列有2 種可能，即Ser-Tyr（SY）、Tyr-Ser（YS）。經過與4 種酪蛋白（α1、α2、β、κ）的氨基酸組成比對，最終確定為αs2-f（56～57）∶YS。

綜合MS檢測結果，與4 種酪蛋白（α1、α2、β、κ）的氨基酸組成比對，組分Ⅱ和組分Ⅲ的短肽片段共有8 個，分別為：從N端，αs1-f（25～35）∶FVAPFPEVFGK，αs 1-f（1 0 3～1 1 1）∶L G Y L E Q L L R，αs 1-f （1 7 8～1 9 0）∶Y V P L G T Q Y T D A P S F，αs 2-f （56～57）∶YS，αs2-f（98～107）∶YQKFPQYLQY，β-f（9 0～1 0 2）∶P V V V P P F L Q P E V M，κ-f （3 4～4 9）∶S R Y P S Y G L N Y Y Q Q K P V，κ-f （52～61）∶INNQFLPYPY。

2.3氨基酸片段的ACE活性抑制效果檢測

將上述8 個片段采用固相合成法制備，純度大于95%，合成產物由上海楚肽生物科技有限公司制備。ACE活性抑制效果檢測采用分光光度方（HHL法）進行檢測。根據研究結果，這些肽片段對ACE活性抑制主要是競爭性抑制，因此，可根據其對ACE活性抑制率的大小及其隨片段質量濃度的變化關系判斷其是否具有ACE活性抑制作用。檢測結果見圖3和表9～16。

圖 3 　αss22-f（566～　5577） ∶YS的質量濃度（AA）、αss22-f（98～110077）∶YQKFPQYLQY質量濃度（BB）、κ-f（522～6611）∶INNQFLPYPY的質量濃度（C）與AACCEE活性抑制率的關系曲線Fig.3　Correlation curves between concentrations of αs2-f （56-57）:YS，αs2-f （98-107）， κ-f （52-61） and percentage inhibition of ACE activity

表 99 　　片段αss11-f（255～　3355）∶FVAPFPEVFGK的ACE活性抑制作用Table 9　Inhibitory effect of αss11-ff （2255-35）:FVAPFPEVFGK on ACE activittyy

表 100 　　片段αss11-f（103～111111）∶LGYLEQLLR對ACE活性的抑制作用Table 10　Inhibitory effect ofαss11-f （110033-111111）∶LGYLEQLLR on ACE activittyy

?表 111 　　片段αss11-f（AC 17 E8活～　性1199的00）抑∶制YV作P用LGTQYTDAAPPSSFF對Table 11　Inhibitory effect of αss11-f （117788-119900）∶YVPLGTQYTDAPSFF oonn ACE activviittyy

根據表12的檢測結果，將樣品αs2-f（56～57）∶YS質量濃度和ACE抑制率進行作圖擬合，結果見圖3A，根據圖3A擬合的方程計算片段αs2-f（56～57）∶YS對ACE抑制的IC50值為11.89 μg/mL。因此，該片段具有很強的ACE活性抑制作用。根據表13的檢測結果，將樣品αs2-f（98～107）∶YQKFPQYLQY質量濃度和ACE抑制率進行作圖擬合，結果見圖3B，經擬合的方程計算片段αs2-f（98～107）∶YQKFPQYLQY對ACE抑制的IC50值為11.75 μg/mL。因此，該片段具有很強的ACE活性抑制作用。根據表16檢測結果，將樣品κ-f（52～61）∶INNQFLPYPY質量濃度和ACE抑制率進行作圖擬合，結果見圖3C，經擬合的方程計算片段κ-f（52～61）∶INNQFLPYPY對ACE抑制的IC50值為421 μg/mL。與水解物的超濾透出物相比（IC50= 250 μg/mL），該值較大，可能不是主要ACE抑制肽。

表 122 　 片段αss22-f（566～　5577） ∶YS對ACE活性的抑制作用Table 12　Inhibitory effect of αss22-ff （5566-5577）∶YS on ACE actiivityy

表 133 　 片段αss22-f（98～110077）∶YQKFPQYLQY對ACE活性抑制作用Table 13　Inhibitory effect ofαss22-ff （9988-110077）∶YQKFPQYLQY on ACE activittyy

表 144 　　片段β-f（90～110022）∶PVVVPPFLQPEVM對ACE活性抑制作用Table 14　Inhibitory effect ofβ-ff （9900-110022）∶PVVVPPFLQPEVMM oonn ACE a　ctivviittyy

表 155 　 片段κ-f（344～4499）∶SRYPSYGLNYYQQQQKKPPVV對ACE活性抑制作用Table 15　Inhibitory effect of κ-ff （3344-4499）∶SRYPSYGLNYYQQKKPPVV，on ACE activiittyy

表 166 　　片段κ-f（522～6611）∶INNQFLPYPY對ACE活性抑制作用Table 16　Inhibitory effect of κ-ff （5522-6611）∶INNQFLPYPY on ACE activittyy

因此，根據上述ACE活性抑制效果檢測，在所獲得的8 個片段中，有3 個具有ACE活性抑制作用，其中αs2-f （56～57）∶YS和αs2-f（98～107）∶YQKFPQYLQY具有很強的ACE活性抑制效果。

3　　討 論

酪蛋白是牛乳中含量最高，種類最多的蛋白質，在其母蛋白中，含有多種生物活性片段，目前，研究人員已從酪蛋白，經不同的蛋白酶或微生物的水解液中分離出多種活性片段，包括抗菌肽［29-31］、促鈣吸收肽［32］、降血壓肽等，其中，研究人員利用不同蛋白酶水解或微生物發酵，從牛乳酪蛋白中分離獲得了多個降壓肽片段（表17）。這些片段，由于所用酶或微生物的不同，其片段的氨基酸組成不同，其組成規律也不完全符合Ile-Lys-Pro （IKP）、Ile-Glu-Pro（IEP）和Ile-Lys-Tyr（IKY）［41］的氨基酸結構組成。本研究模擬人體消化系統，先經胃蛋白酶水解，再經胰蛋白酶水解酪蛋白，獲得的具有ACE活性抑制肽，αs2-f（56～57）∶YS、αs2-f（98～107）∶YQKFPQYLQY 和κ-f（52～61）∶INNQFLPYPY，在食用過程中，不會受胃腸系統蛋白酶的影響而發生結構變化，功能穩定。另外，其氨基酸組成，特別是αs2-f（56～57）∶YS，不符合文獻［41］規律，但具有很好的ACE抑制活性。根據目前的研究，源于蛋白質水解物的肽片段與ACE之間的相互作用為競爭性抑制，肽與ACE嵌合的袋狀部位可分為S1、S2和S1'，其中S1袋狀部位由Ala 354、Glu 384和Tyr 523殘基組成；S2袋狀部位由Gln 281、His 353、Lys 511、His 513和Tyr 520殘基組成；S1'含有Glu 162殘基［42-43］。另外，不同來源的ACE抑制物與ACE嵌合作用的部位不同［44］。對于所獲得的3 個片段，與ACE如何進行作用，還需要進一步研究。

表 17 源于牛乳酪蛋白的ACE抑制肽TTaabbllee 1177 　　AACCEE iinnhhiibbiittiioonn ppeeppttiiddee ffrroomm bboovviinnee ccaasseeiinn

［1］張艷， 胡志和. 乳蛋白源ACE抑制肽的研究進展［J］. 食品科學， 2008，29（10）: 634-640.

［2］張美莉. 食品功能成分的制備及其應用［M］. 北京: 中國輕工業出版社， 2007: 111-113.

［3］YAMAMOTO N. Antihypertensive peptides derived from food proteins［J］. Biopolymers Peptide Science， 1997， 43（2）: 129-134.

［4］王增， 袁梅琴， 楊國濃， 等. ACEI/ARB類降壓藥物在腫瘤治療中的臨床研究進展［J］. 2015， 20（2）: 230-234.

［5］段練. 常用降壓藥物的不良反應研究進展［J］. 世界中西醫結合雜志，2014， 9（11）: 1247-1251

［6］郭小芳. 不同降壓藥對痛風合并高血壓患者代謝指標的干預值［J］.中國處方藥， 2015， 13（4）: 11-12.

［7］李玉明， 楊寧. 高血壓合并代謝綜合征的降壓藥物選擇［J］. 中國實用內科雜志， 2015， 35（1）: 45-47.

［8］CONTRERAS M D M， CARRóN R， MONTERO M J， et al. Novel casein-derived peptides with antihypertensive activity［J］. International Dairy Journal， 2009， 19（10）: 566-573.

［9］NORRIS R， POYARKOV A， O' KEEFFE M B， et al. Characterisation of the hydrolytic specificity of Aspergillus niger derived prolyl endoproteinase on bovine β-casein and determination of ACE inhibitory activity［J］. Food Chemistry， 2014， 156（8）: 29-36.

［10］ NORRIS R， O' KEEFFE M B， POYARKOV A， et al. Peptide iden tification and angiotensin converting enzyme （ACE） inhibitory activity in prolyl endoproteinase digests of bovine αs-casein［J］. Food Chemistry， 2015， 188（1）: 210-217.

［ 11］ MARUYAMA S， SUZUKI H. A peptide inhibitor of angiotensinⅠ-converting enzyme in the tryptic hydrolysate of casein［J］. Agriculture Biology Chemistry， 1982， 46（5）: 1393-1394.

［12］ KOHMURA M， NIO N， ARIYOSHI Y. Inhibition of angiotensin Ⅰ-converting enzy me by synthetic peptides of human κ-casein［J］. Agricultural and Biological Chemistry， 1990， 54（3）: 825-836.

［13］ YAMAMOTO N. Antihypertensive peptides derived from food proteins［J］. Biopolymers Peptide Science， 1997， 43（2）: 129-134.

［14］ FERREIRA I M P L V O， PINHO O， MOTA M V， et al. Preparation of ingredients containing an ACE-inhibitory peptide by tryptic hydrolysis of whey protein concentrates［J］. International Dairy Journal， 2007，17（5）: 481-487.

［15］ COSTA E L D， GONTIJO J A D， NETTO F M. Effect of heat and enzymatic treatment on the antihypertensive activity of whey protein hydrolysates［J］. International Dairy Journal， 2007， 17（6）: 632-640.

［16］ BALTI R， BOUGATEF A， SILA A， et al. Nine novel angiotensin Ⅰ-converting enzyme （ACE） inhibitory peptidesfrom cuttlefi sh （Sepia offi cinalis） muscle protein hydrolysates and antihypertensive effect of the potent active peptide in spontaneously hypertensive rats［J］. Food Chemistry， 2015， 170（5）: 519-525.

［17］ WU S G， FENG X Z ， LAN X D， et al. Purifi cation and identifi cation of angiotensin-Ⅰ converting enzyme （ACE） inhibitory peptide from lizard fish （Saurida elongata） hydrolysate［J］. Journal of Functional Foods， 2015， 13（3）: 295-299.

［18］ KLEEKAYAI T， HARNEDY P A， O' KEEFFE M B， et al. Extraction of antioxidant and ACE inhibitory peptides from Thai traditional fermented shrimp pastes［J］. Food Chemistry， 2015， 176（6）: 441-447.

［19］ WUA Q， JIA J， YAN H， et al. A novel angiote nsin-Ⅰ converting enzyme （ACE） inhibitory peptide from gastrointestinal protease hydrolysate of silkworm pupa （Bombyx mori） protein: biochemical characterization and molecular docking study［J］. Peptides， 2015，68（6）: 17-24.

［20］ MAJUMDER K， CHAKRABARTI S， MORTON J S， et al. Eggderived ACE-inhibitory peptides IQW and LKP reduce blood pressure in spontaneously hypertensive rats［J］. Journal of Functional Foods，2015， 13（3）: 50-60.

［21］ SALAMPESSY J， REDDYA N， KAILASAPATHY K， et al. Functional and potential therapeutic ACE-inhibitory peptides derived from bromelain hydrolysis of trevally proteins［J］. Journal of Functional Foods， 2015， 14（4）: 716-725.

［22］ TOOPCHAM T， ROYTRAKUL S， YONGSAWATDIGUL J. Characterization and identifi cation of angiotensin Ⅰ-converting enzyme （ACE） inhibitory peptides derived from tilapia using Virgibacillus halodenitrifi cans SK1-3-7 proteinases［J］. Journal of Functional Foods，2015， 14（4）: 435-444.

［23］ 江利華， 王璋. 花生ACE抑制肽的分離純化、結構鑒定及體內降血壓功能研究［J］. 食品工業科技， 2009， 30（10）: 94-100.

［24］ WU J P， DING X L. Hypotensive and physiological effect of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides derived from soy protein on spontaneously hypertensive rats［J］. Food Chemistry， 2001，49（1）: 501-506.

［25］ WU Jianping， DING Xiaolin. Characterization of inhibition and stability of soy-protein-derived angiotension Ⅰ-converting enzyme inhibitory peptides［J］. Food Research International， 2002， 35（4）: 367-375.

［26］ 魯軍， 任迪峰， 王建中， 等. 螺旋藻源血管緊張素轉化酶抑制肽的純化和鑒定［J］. 生物化學與生物物理進展， 2010， 37（5）: 568-574.

［27］ 楊銘， 胡志和. 酪蛋白雙酶水解物ACE抑制肽的分離純化［J］. 食品科學， 2012， 33（9）: 50-53.

［28］ CUSHMAN D W， CHEUNG H S. Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung［J］. Biochemical Pharmacology， 1971， 20（7）: 1637-1648.

［29］ GHODAKE G， LIM S R， LEE D S. Casein hydrolytic peptides mediat ed green synthesis of antibacte rial silver nanoparticles［J］. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces， 2013， 108（8）: 147-151.

［30］ 龐廣昌， 胡志和， 陳慶森， 等. 具有抗菌作用的免疫活性肽（Trpi）: 中國， 03137304.6［P］. 2007-05-02.

［31］ IVáN L E， GóMEZ-RUIZ J á， AMIGO L， et al. Identification of antibacterial peptides from ovine αs2-casein［J］. International Dairy Journal， 2006， 16（9）: 1072-1080.

［32］ IMRAN F， MOHEET I A， IMRAN Z， et al. A review of novel dental caries preventive material: casein phosphopeptide-amorphous calciumphosphate （CPP-ACP） complex［J］. King Saud University Journal of Dental Sciences， 2013， 4（2）: 47-51.

［33］ JEANETTE O， SHALABY S M A， ZAKORA M， et al. Fractionation and identification of ACE-inhibitory peptides from α-lactalbumin and β-casein produced by thermolysin-catalysed hydrolysis［J］. International Dairy Journal， 2007， 17（12）: 1460-1472.

［34］ YAMADA A， SAKURAI T， OCHI D， et al. Antihypertensive effect of the bovine casein-derived peptide Met-Lys-Pro［J］. Food Chemistry，2015， 172（4）: 441-446.

［35］ GOBBA C D， TOMP A， OTTE J. Bioactive peptides from caseins released by cold active proteolytic enzymes from Arsukibacterium ikkense［J］. Food Chemistry， 2014， 165（23）: 205-215.

［36］ JIANG Z M， TIAN B， BRODKORB A， et al. Production， analysis and in vivo evaluation of novel angiotensin-Ⅰ-converting enzyme inhibitory peptides from bovine casein［J］. Food Chemistry， 2010，123（3）： 779-786.

［37］ ONG L， SHAH N P. Release and identification of angiotensinconverting enzyme-inhibitory peptides as influenced by ripening temperatures and probiotic adjuncts in Cheddar cheeses［J］. LWT-Food Science and Technology， 2008， 41（9）： 1555-1566.

［38］ QUIRóS A， RAMOS M， MUGUERZA B， et al. Identification of novel antihypertensive peptides in milk fermented with Enterococcus faecalis［J］. International Dairy Journal， 2007， 17（1）: 33-41.

［39］ TAUZIN J， MICLO L， GAILLARD J L. Angiotensin-Ⅰ-converting enzyme inhibitory peptides from tryptic hydrolysate of bovine αS2-casein［J］. FEBS Letters， 2002， 531（2）: 369-374.

［40］ CONTRERAS M D M， CARRóN R， MONTERO M J， et al. Novel casein-derived peptides with antihypertensive activity［J］. Journal of Dairy Science， 2009， 19（10）: 566-573.

［41］ JIMSHEENA V K， GOWDA L R. Arachin derived peptides as selective angiotensin Ⅰ converting enzyme （ACE） inhibitors: structureactivity relationship［J］. Peptides， 2010， 31（6）: 1165-1176.

［42］ ROHIT A C， SATHISHA K， APARNA H S. A variant peptide of buffalo colostrum betalactoglobulin inhibits angiotensin Ⅰ-converting enzyme activity［J］. European Journal of Medicinal Chemistry， 2012，53: 211-219.

［43］ WU Q Y， JIA J Q， YAN H， et al. A novel angiotensin-Ⅰ converting enzyme （ACE） inhibitory peptidefrom gastrointestinal protease hydrolysate of silkworm pupa （Bombyx mori） protein: biochemical characterizatio n and molecular docking study［J］. Peptides， 2015， 68: 17-24.

［44］ KO S C， JUNG W K， KANG S M， et al. Angiotensin Ⅰ-converting enzyme （ACE） inhibition and nitric oxide （NO）-mediated antihypertensive effect of octaphlorethol A isolated fromIshige sinicola: in vitro molecular mechanism and in vivo SHR model［J］. Journal of Functional Foods， 2015， 18: 289-299.

Separation of ACE Inhibitory Peptides from Casein Hydrolysate and Analysis of Their Amino Acid Sequences

HU Zhihe1，2， XIA Lei1， SUN Zhengang3， WU Wenqi3， FENG Yongqiang3， XUE Lu1，2， LIU Xujin1， JIA Ying1
（1. College of Biotechnology and Food Science， Tianjin University of Commerce， Tianjin300134， China；
2. Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnology， Tianjin300134， China；3. Tianjin Haihe Dairy Co. Ltd.， Tianjin300402， China）

The objectives of this study were to separate angiotensin converting enzyme （ACE） inhibitory peptides from casein hydrolysate produced by sequential hydrolysis of casein with pepsin followed by trypsin and to analyze their amino acid sequences. The hydrolysate was concentrated by ultrafiltration and separated by Sephadex G-15 column chromatography into three components. Components Ⅱ and Ⅲ， which had higher inhibitory effect on ACE activity， were collected. Ion chromatography was used to analyze amino acid composition of fragments from the two components. LCMS/MS was used to analyze amino acid sequence of fragments， solid-phase synthesis was used to synthetize short-chain peptides， and a spectrophotometric method was used to test the inhibitory effect of hydrolysate on ACE activity. Results showed that component Ⅱ contained eight amino acids including valine， serine， proline， leucine， phenylalanine， glutamatic acid， asparaginic acid， and tyrosine； while component Ⅲ contained trace amounts of serine and tyrosine. Eight fragments were obtained from both components by LC-MC/MC analysis， including three ACE inhibitory fragments αs2-f （56-57）:YS，αs2-f （98-107）:YQKFPQYLQY and κ-f （52-61）:INNQFLPYPY with half maximal inhibitory concentration （IC50） of 11.89，11.75 and 421 μg/mL， respectively.

bovine casein； pepsin； trypsin； angiotensin converting enzyme （ACE）； inhibitory peptide

TS252.42

A

1002-6630（2015）24-0156-08

10. 7506/spkx1002-6630-201524028

2015-06-28

天津市科技支撐項目（14ZCZDNC00017）；天津市高等學校創新團隊項目（TD12-5049）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃重點項目（14JCZDJC34500）；天津市北辰區科技計劃補助項目（2014-CXYH-KF-001）

胡志和（1962—），男，教授，碩士，研究方向為專用功能食品。E-mail：hzhihe@tjcu.edu.cn