拉曼光譜法檢測靈芝孢子油氧化酸敗

能 靜，項延楠，孫培龍*

（浙江工業(yè)大學海洋學院，浙江 杭州　　310014）

拉曼光譜法檢測靈芝孢子油氧化酸敗

能 靜，項延楠，孫培龍*

（浙江工業(yè)大學海洋學院，浙江 杭州310014）

采用拉曼光譜法直接監(jiān)測靈芝孢子油中氧化酸敗過程中不飽和雙鍵特征峰的變化規(guī)律，研究了特征峰的強度與孢子油氧化酸敗程度的關(guān)系。結(jié)果表明，特征峰強度隨孢子油酸值、過氧化值的增加而下降，特征峰的面積與孢子油酸值之間存在著良好的線性關(guān)系，并進一步測定了靈芝孢子油氧化酸敗的動力學參數(shù)。建立了用拉曼光譜快速檢測靈芝孢子油氧化酸敗度的新方法。對該方法的有效性進行評估，并用該方法篩選出有效的靈芝孢子油抗氧化劑。

拉曼光譜法；靈芝孢子油；氧化酸敗；快速檢測

靈芝又稱靈芝草，是多孔菌科植物赤芝或紫芝的全株，自古以來就被推崇為中藥上品，在《神農(nóng)本草經(jīng)》等中醫(yī)藥典籍就早有記載。經(jīng)數(shù)十年的現(xiàn)代藥理學研究證明，靈芝對于增強人體免疫力、抑制腫瘤、調(diào)節(jié)血糖、控制血壓、輔助化療、保肝護肝，促進睡眠等方面均具有顯著療效［1］。靈芝孢子是靈芝的有性生殖細胞，一般呈淡褐色至黃褐色，卵形，大小一般在（8.5～11.2） μm×（5.2～6.9） μm（長×寬）之間，內(nèi)含靈芝孢子油。靈芝孢子油集中了靈芝有效成分的精華，富含三萜類靈芝酸、靈芝多糖、核苷、氨基酸、飽和與不飽和脂肪酸、有機鍺以及其他微量元素等多種活性成分［2］。眾多研究已經(jīng)表明，靈芝孢子油具有增強細胞免疫、增強NK細胞活性、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等功能，能直接抑殺腫瘤干細胞，抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞的凋亡［3-5］，抗氧化［6］和減輕膀胱堵塞［7］，以及抗艾滋病毒的活性的能力［8-9］。同時由于其不飽和脂肪酸含量很高，更具有改善心腦血管疾病、抗動脈硬化、降血脂、降膽固醇的作用［10］。

由于靈芝孢子油功效顯著，價格昂貴，所以市場上相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量參差不齊，嚴重影響了消費者的利益。靈芝孢子油富含不飽和雙鍵，孢子油在儲存、運輸過程中，尤其在高溫、高濕的條件下極易氧化，主要發(fā)生由活性氧自由基攻擊雙鍵引起降解，產(chǎn)生多種醛、酮、醇、酸及羥酸等有害氧化物、過氧化物，生成強烈的刺激性氣味（氧化酸敗）［11］。這些氧化物、過氧化物被人體攝取后，將破壞機體正常的生理生化功能（如引起機體氧化應激反應，降低機體免疫功能、導致小腸、肝臟等器官肥大等），嚴重損害身體健康［12］。

因此，檢測靈芝孢子油氧化酸敗度是靈芝孢子油質(zhì)量控制的一個關(guān)鍵。目前，業(yè)內(nèi)通常采用食用油的質(zhì)量監(jiān)控指標即過氧化值、酸值作為孢子油的主要質(zhì)量監(jiān)控指標［13］。測定靈芝孢子油酸值、過氧化值的傳統(tǒng)方法主要是標準酸堿滴定和氧化還原滴定，但滴定法多少存在以下缺陷：如操作繁雜，需專業(yè)人員在實驗室進行分析；耗時長，檢測需數(shù)小時完成；不便攜，難以戶外現(xiàn)場檢測；靈敏度不夠高，消耗樣品量多（5～10 g），檢測成本高。如根據(jù)中國藥典一部中對酸敗法測定的規(guī)定［14］以及GB/T 5009.37—2003《食用植物油衛(wèi)生標準的分析方法》［15］，每次滴定操作需消耗靈芝孢子油0.5 g和1.5 g來分別測定其酸值和過氧化值，3 次重復滴定至少消耗孢子油6.0 g。因此，開發(fā)一種簡單、快速、靈敏度高、樣品消耗量少、檢測成本低的孢子油酸值和過氧化值檢測新技術(shù)對保障靈芝孢子油的生產(chǎn)質(zhì)量、規(guī)范靈芝孢子油銷售市場、開發(fā)新的靈芝深加工產(chǎn)品都具有十分重要的意義。

近年來引起國內(nèi)外廣泛關(guān)注的拉曼光譜技術(shù)為開發(fā)靈芝孢子油氧化酸敗檢測新技術(shù)提供了契機。拉曼光譜是1928年印度物理學家拉曼發(fā)現(xiàn)的一種分子振動光譜，傳統(tǒng)高效液相色譜、核磁共振波譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、熒光光譜等方法相比，拉曼光譜技術(shù)具有諸多優(yōu)點，如能夠直接對樣品無損傷的定量、定性分析，無需對樣品進行復雜預處理，樣品用量少，操作簡便，測定時間短，靈敏度高，譜峰尖銳，可明顯表征特定分子的結(jié)構(gòu)等，因而近年來拉曼光譜技術(shù)已廣泛用于食品分析［16-22］、環(huán)境監(jiān)測［23］、藥物分析［24-25］、醫(yī)學鑒定等領域［26-28］。為此，本實驗將利用拉曼光譜技術(shù)建立一種靈芝孢子油氧化酸敗的動態(tài)監(jiān)測方法以及靈芝孢子油酸值、過氧化值的快速檢測新技術(shù)，并利用該方法測定靈芝孢子油氧化酸敗的動力學參數(shù)，篩選出高效的靈芝孢子油抗氧化劑。

1　　材料與方法

1.1材料與試劑

靈芝孢子油樣品浙江金華壽仙谷醫(yī)藥股份有限公司。

茶多酚、生育酚（VE）、特丁基對苯二酚（tertiary butylhydroquinone，TBHQ）、鄰苯二甲酸氫鉀、重鉻酸鉀（均為分析純）阿拉丁試劑（上海）有限公司；酚酞、淀粉、碘化鉀、氫氧化鈉、硫代硫酸鈉、無水碳酸鈉、乙醇、乙醚、氯仿、冰醋酸（均為分析純）華東醫(yī)藥試劑股份有限公司。

1.2儀器與設備

DeltaNu?Advantage 785型近紅外拉曼光譜儀（波長785 nm、激光功率120 mW、分辨率4 cm－1、帶NuScope數(shù)字顯微鏡和XYZ三維載物臺）美國DeltaNu公司；MK-20干式恒溫器（控溫范圍：－10～100 ℃）杭州奧盛儀器有限公司；RCT磁力攪拌器德國IKA?RCT Basic公司；BSA224S型電子天平德國Sartorius AG公司。

1.3方法

1.3.1靈芝孢子油酸值的檢測

根據(jù)GB/T 5009.37—2003，用氫氧化鈉標準滴定法測靈芝孢子油酸值：在250 mL錐形瓶中事先加入乙醇、乙醚各25.0 mL混合，精確稱取靈芝孢子油樣品0.500 g加入錐形瓶中，振蕩使其完全溶解。用氫氧化鈉滴定液（0.1 mol/L）滴定至粉紅色并連續(xù)30 s不褪色，讀取消耗氫氧化鈉滴定液體積（mL）。

酸值的計算見公式（1）：

式中：AV為酸值/（mg NaOH/g）；A為消耗氫氧化鈉滴定液（0.1 mol/L）的體積/mL；W為試樣取樣量/g；5.61為每毫升氫氧化鈉滴定液（0.1 mol/L）相當于氫氧化鈉的毫克數(shù)，可根據(jù)標定后氫氧化鈉滴定液的準確濃度進行校正。

乙醚和乙醇的混合物配制：取乙醇、乙醚各25.0 mL于250 mL錐形瓶混勻，臨用前先加0.5%的酚酞指示液1 mL，搖勻，滴加氫氧化鈉滴定液適量，調(diào)至微顯粉紅色。

0.1 mol/L氫氧化鈉滴定液的配制：先配制氫氧化鈉飽和溶液，稱取過量氫氧化鈉固體溶于蒸餾水中，其中氫氧化鈉固體溶解度為111 g（20 ℃），移液管準確移取上清液1.4 mL于250 mL容量瓶中用新煮沸冷卻的無二氧化碳蒸餾水定容。

氫氧化鈉滴定液的標定：精確稱取在105 ℃干燥至質(zhì)量恒定的基準鄰苯二甲酸氫鉀約0.600 g，加新沸過的冷水50.0 mL振搖，使其盡量溶解；加0.5%酚酞指示液2 滴，用本液滴定至溶液顯粉紅色。每1 mL的氫氧化鈉滴定液（0.1 mol/L）相當于20.42 mg的鄰苯二甲酸氫鉀。標定濃度（C）結(jié)果的計算見公式（2）：

式中：W為鄰苯二甲酸氫鉀的稱樣量/g；V為標定時消耗氫氧化鈉滴定液的體積/mL。

0.5%酚酞溶液的配制：稱取0.50 g酚酞，溶解于100 mL 95%的乙醇溶液中，無需加水。實驗重復3 次并計算其平均值。

1.3.2靈芝孢子油過氧化值的檢測

在250 mL干燥碘瓶中加入1.500 g的靈芝孢子油，之后混入按調(diào)制的氯仿-冰醋酸（1∶1，V/V）的混合液30.0 mL，通過不斷振蕩搖勻樣品。待充分搖勻后加入約1.0 mL新配制的碘化鉀飽和溶液，加入后輕輕搖動半分鐘時間，待搖勻后放置于暗處靜置5 min。隨后向碘瓶內(nèi)加水80.0 mL，使之混勻，然后用標準硫代硫酸鈉滴定液（0.1 mol/L）滴定，先滴定至溶液呈現(xiàn)淺黃色，然后加入淀粉溶液，作為反應指示劑，滴定至藍色消失，此時達到的即為滴定終點。以硫代硫酸鈉溶液的體積消耗數(shù)，計算油脂的過氧化值。每次實驗重復3 次并計算其平均值。計算見公式（3）：

式中：POV為過氧化值/（mmol/kg）；V1為樣品消耗的標準硫代硫酸鈉體積/mL；V2為空白實驗消耗的標準硫代硫酸鈉體積/mL；M為樣品質(zhì)量/g。

硫代硫酸鈉標準滴定液配制：稱取硫代硫酸鈉26.0 g，與無水碳酸鈉0.20 g，加新沸過的冷水溶解成1 000 mL，搖勻，放置1 個月，過濾后備用。

硫代硫酸鈉標準滴定液的標定：精確稱取在120 ℃干燥至質(zhì)量恒定的基準重鉻酸鉀0.150 g，放置于碘量瓶中。加水50 mL溶解，加碘化鉀2.0 g，輕輕振搖溶解，加稀硫酸40 mL，搖勻，在暗處放置10 min，加水250 mL稀釋，用本液滴定近終點時，加淀粉指示液3 mL，繼續(xù)滴定到藍色消失而顯亮綠色，并將滴定的結(jié)果用空白實驗校正。每1 mL的 硫代硫酸鈉滴定液（0.1 mol/L）相當于4.903 mg的重鉻酸鉀。根據(jù)本液消耗量與重鉻酸鉀的用量，算出本液的準確質(zhì)量濃度（F），計算見公式（4）：（4）

式中：Ms為重鉻酸鉀的質(zhì)量/g；V為滴定所耗硫代硫酸鈉滴定液的體積/mL；V0為空白實驗所耗硫代硫酸鈉滴定液的體積/mL。

1.3.3靈芝孢子油拉曼光譜檢測

取200 μL孢子油置于200 μL樣品管中，放入拉曼光譜儀樣品池中，激光強度選擇高檔，激光聚焦點為樣品管中心，激光照射時間設定為10 s，儀器自動環(huán)境雜散光校準和基線校正。每個樣品由儀器連續(xù)掃描5 次，儀器自動平均后得到靈芝孢子油的拉曼光譜圖。儀器可以自動連續(xù)測定樣品，從而可以對樣品進行動態(tài)監(jiān)測。

1.3.4靈芝孢子油氧化酸敗的動態(tài)監(jiān)測

影響靈芝孢子油酸值和過氧化值的重要因素是溫度、光線、空氣，且溫度的影響大于空氣和光線的影響［29］。參照Schaal烘箱加速法［30］，準確稱取5 份靈芝孢子油，一份置于冰箱中密封避光條件下做為對照樣保存，其他4 份分別置于10、35、50、70 ℃恒溫器中避光敞口保存，每隔24 h攪拌一次混勻，定期取樣，用拉曼光譜儀測定靈芝孢子油的拉曼光譜圖，并根據(jù)中國藥典一部［14-15］中對油脂測定的規(guī)定測定各自的酸值和過氧化值，實驗重復3 次并計算其平均值。

1.3.5抗氧化劑對靈芝孢子油穩(wěn)定性的影響

根據(jù)GB 2760—2011《食品添加劑使用標準》的規(guī)定，TBHQ在油脂中的最大許可使用量為0.02%，所以本實驗選擇TBHQ、VE、茶多酚3 種抗氧化劑并分別按0.02%的劑量添加。參照Schaal烘箱加速法［30］，準確稱取4 份靈芝孢子油，一份不添加抗氧劑做為對照樣，其他3 份分別添加TBHQ、VE和茶多酚，置于70 ℃恒溫器中避光敞口保存，每隔24 h攪拌一次混勻，定期取樣，用拉曼光譜儀測定靈芝孢子油的拉曼光譜圖。并根據(jù)中國藥典一部［14］中對油脂測定的規(guī)定測定各自的酸值和過氧化值，實驗重復3 次并計算其平均值。

2　　結(jié)果與分析

2.1靈芝孢子油的拉曼光譜分析

圖 1　　靈芝孢子油的拉曼光譜圖Fig.1　　Raman spectrum of Ganoderma lucidum spore oil

如圖1所示，根據(jù)參考文獻［31-32］，對其中的主要特征峰對應的分子結(jié)構(gòu)官能團指認如下。1 745.6 cm－1對應于分子中羰基C=O的伸縮振動峰，1 654.5 cm－1對應于不飽和雙鍵的伸縮振動峰，1 439.2 cm－1對應于烴基碳氫鍵CH剪式振動峰，1 300.9 cm－1對應于烴基的變形振動峰。在拉曼光譜中，碳-碳雙鍵通常以很強的特征峰出現(xiàn)，峰的強度在一定濃度范圍內(nèi)與雙鍵的濃度呈正比關(guān)系，當雙鍵發(fā)生氧化降解酸敗時，峰的強度下降，從而可以通過測定碳-碳雙鍵的特征拉曼峰強度來直接檢測碳-碳雙鍵的降解程度。根據(jù)文獻［11，33-34］研究，不飽和油脂、植物油及靈芝孢子油等氧化酸敗的本質(zhì)主要是其中含有的不飽和雙鍵發(fā)生氧化降解酸敗的結(jié)果［11］。孢子油拉曼譜圖中1 655 cm－1雙鍵伸縮振動峰的強度在一定濃度范圍內(nèi)與雙鍵濃度呈比例關(guān)系，所以可以通過檢測1 655 cm－1的雙鍵峰強度來對靈芝孢子油的氧化酸敗進行定量分析。

2.2靈芝孢子油氧化酸敗過程的動態(tài)監(jiān)測

靈芝孢子油氧化酸敗的本質(zhì)是其中含有的不飽和雙鍵發(fā)生氧化的結(jié)果［11］。孢子油拉曼譜圖中位于1 655 cm－1的雙鍵伸縮振動峰的強度在一定濃度范圍內(nèi)與雙鍵的濃度呈正比，所以可以通過檢測1 655 cm－1的雙鍵峰強度來動態(tài)監(jiān)測孢子油的氧化酸敗過程。相比于其他監(jiān)測孢子油氧化酸敗的技術(shù)手段（如核磁、高效液相色譜、質(zhì)譜等），拉曼光譜技術(shù)更具有簡單、直接、快捷，受氧化中間產(chǎn)物（如醛、酮）的影響小，樣品無需復雜預處理等優(yōu)點。

在恒溫50 ℃條件下，靈芝孢子油暴露在空氣中，于5、7、14、2、28、35 d取樣時的拉曼光譜圖如圖2所示。可以看出，50 ℃時靈芝孢子油從第7天起就發(fā)生了明顯的氧化酸敗，14 d后大約2/3的不飽和雙鍵酸已經(jīng)破壞，說明50 ℃溫度條件下靈芝孢子油氧化酸敗的速度很快。

圖 2　靈芝孢子油在50 ℃時長時間氧化酸敗的拉曼光譜監(jiān)測圖Fig.2　Raman spectra showing the oxidative rancidity ofGanoderma lucidum spore oil at 50 ℃

以拉曼光譜圖中雙鍵峰的積分強度對時間作圖得到靈芝孢子油隨時間變化的酸敗曲線，將不同反應溫度條件下（10、35、50、70 ℃）得到酸敗曲線繪于圖3a中，可以看出，溫度對孢子油氧化酸敗的速度影響十分明顯，10 ℃時靈芝孢子油經(jīng)過20 d氧化酸敗也很少，而70 ℃時經(jīng)過數(shù)小時大部分孢子油即發(fā)生了酸敗。由酸敗曲線的斜率求出初始反應速率常數(shù)，根據(jù)阿倫尼烏斯定律，以反應速率常數(shù)（lnk）對溫度的倒數(shù)（1/T）作圖，如圖3b所示，計算得到氧化酸敗反應的表觀活化能為?E = 44.35 kJ/mol。

圖 3　　反應溫度對靈芝孢子油氧化酸敗反應的影響Fig.3　　Effect of temperature on the oxidative rancidity of Ganoderma lucidum spore oil

2.3靈芝孢子油抗氧化劑的篩選

圖 4　　添加不同抗氧化劑的靈芝孢子油氧化酸敗隨時間變化曲線Fig.4　　Time courses of oxidative rancidity of Ganoderma lucidum spore added with different antioxidants

由于采用拉曼光譜技術(shù)可以簡單、快捷、直接地監(jiān)測靈芝孢子油氧化酸敗過程，從而可以通過高溫加速實驗進行孢子油抗氧化劑的快速篩選。如圖4所示，在70 ℃條件下，監(jiān)測添加0.02%抗氧劑和不加抗氧劑孢子油的氧化酸敗速率，很顯然，不加抗氧劑的孢子油數(shù)小時內(nèi)很快被氧化，抗氧化效果：VE＞茶多酚＞TBHQ，添加VE

的孢子油6 d后（雙鍵峰強度下降約5%）才出現(xiàn)輕微氧化酸敗。根據(jù)前面得到活化能數(shù)據(jù)（?E = 44.35 kJ/mol），可以計算出在室溫條件下（20 ℃）靈芝孢子油貨架期可達90 d左右。在密閉低溫的環(huán)境中，增加VE用量，可進一步顯著延長孢子油的貨架期。

2.4靈芝孢子油酸值、過氧化值的快速檢測

圖 5　孢子油氧化酸敗后產(chǎn)生的酸值（a）以及過氧化值（bb）與雙鍵拉曼峰的積分強度關(guān)系Fig.5　Plots of Raman peak intensity versus acid value （a） and peroxide value （b） for oxidative rancidity of Ganoderma lucidum spore oil added with different antioxidants

根據(jù)圖4的結(jié)果，以孢子油雙鍵拉曼峰的積分強度與用標準滴定法測出孢子油酸值作圖，如圖5a所示，可以看出，無論添加抗氧化劑與否，雙鍵拉曼峰的積分強度與其酸值都有十分良好的線性關(guān)系，表明可以利用拉曼光譜法對孢子油氧化酸敗過程中產(chǎn)生的酸值進行快速定量檢測。根據(jù)文獻［35-36］的研究，傳統(tǒng)酸堿滴定法檢測油脂酸值具有如下局限性：1）酸堿滴定的終點依賴于指示劑顏色的微弱變化，不同個體間終點判斷差異較大，特別當油脂帶有顏色時誤差更大；2）所需油脂樣品消耗量大（5～10 g），溶液配制、標定、滴定耗費時間長（幾小時）；3）該法所需化學試劑與藥品多，需要繁瑣配制標定溶液，難以實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測的要求。而拉曼光譜法無需人工終點判定與溶液配制標定，檢測時間快（幾分鐘），樣品消耗量少（普通樣品管：0.2 mL，毛細樣品管：0.02 mL），操作簡單便捷，可現(xiàn)場快速檢測，從而使該檢測方法具有相當大的實際應用前景。

用同樣的方法，以孢子油雙鍵拉曼峰的積分強度與用滴定法測出孢子油過氧化值作圖，如圖5b所示。雖然拉曼強度與過氧化值不呈現(xiàn)線性關(guān)系，但仍然可以通過非線性 擬合（軟件：Origin 8.0，S擬合）通過內(nèi)插值的方式對靈芝孢子油的過氧化值進行快速測定。

3　　結(jié) 論

綜上結(jié)果，本實驗利用拉曼光譜技術(shù)直接檢測靈芝孢子油中不飽和雙鍵來監(jiān)測不同溫度條件下的靈芝孢子油氧化酸敗過程，發(fā)現(xiàn)溫度對孢子油的氧化酸敗速率影響十分明顯，計算出氧化酸敗反應表觀活化能為44.35 kJ/mol，通過高溫加速實驗篩選出VE做為孢子油的有效抗氧化劑，在室溫開口的環(huán)境下使孢子油的貨架期達到90 d，在密閉低溫的環(huán)境中貨架期更長。

通過與傳統(tǒng)標準滴定法對比，發(fā)現(xiàn)雙鍵拉曼峰的積分強度與孢子油的酸值之間存在良好線性關(guān)系，從而可利用拉曼光譜法對孢子油氧化酸敗過程中產(chǎn)生的酸值進行定量檢測。相比于傳統(tǒng)酸堿滴定，該方法簡單、方便、快捷，用樣量少，成本低廉，具有實際應用前景。

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Rapid Detection of Oxidative Rancidity of Ganoderma lucidum Spore Oil by Raman Spectroscopy

NENG Jing， XIANG Yannan， SUN Peilong*
（Ocean College， Zhejiang University of Technology， Hangzhou310014， China）

In this work， Raman spectroscopy was employed to directly monitor the changes in the characteristic peaks of the unsaturated double bonds of Ganoderma lucidum spore oil during oxidative rancidity and the relationship between the peak intensity and oxidative rancidity was discussed. Raman scattering intensity decreased with increasing acid value and peroxide value and a linear correlation between acid value and the area of the characteristic peaks was determined. The kinetic parameters for the oxidative rancidity of Ganoderma lucidum spore oil were also determined. As a result， a new and fast approach for the detection of oxidative rancidity in Ganoderma lucidum spore oil by Raman spectroscopy was established. This method was further validated and used to measure the kinetic parameters of oxidative rancidity and screen antioxidants for Ganoderma lucidum spore oil.

Raman spectroscopy； Ganoderma lucidum spore oil； oxidative rancidity； rapid detection

TS207.3

A

1002-6630（2015）24-0200-05

10.7506/spkx1002-6630-201524037

2015-01-19

國家自然科學基金青年科學基金項目（31301483）；浙江省食藥用菌產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟建設項目（2011LM201）；浙江省教育廳科研項目（Y201329221）

能靜（1985—），女，講師，博士，研究方向為食品安全與檢測。E-mail：nengjing@zjut.edu.cn

孫培龍（1964—），男，教授，博士，研究方向為食品化學與資源利用。E-mail：sun_pl@zjut.edu.cn