禽肉制品中單增李斯特菌的DiversiLab分型

鄭 晶，唐中偉，2，陳 彬，黃曉蓉，林 杰，張體銀

（1.福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福建 福州　　350001；2.福建農林大學食品科學學院，福建 福州　　350002）

禽肉制品中單增李斯特菌的DiversiLab分型

鄭 晶1，唐中偉1，2，陳 彬1，黃曉蓉1，林 杰1，張體銀1

（1.福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福建 福州350001；2.福建農林大學食品科學學院，福建 福州350002）

目的：研究從同一類食品中分離出的單增李斯特菌間的同源性關系，為預測預警保障食品安全和食源性疾病溯源提供科學依據和技術支持。方法：應用DiversiLab分型系統對2001—2010年福建出入境檢驗檢疫局從各類禽肉制品中 分離出的25 株單增李斯特菌進行分型，其中包括：DNA提取、重復序列-聚合酶鏈式反應（repetitive sequence-based polymerase chain reaction，rep-PCR）、微電泳芯片分離檢測及數據分析。結果：DiversiLab分型中，相似系數為95%時，25 株菌被分為了6 組（G）；相似系數為97%時，25 株菌被分為11 組（P）。結論：DiversiLab分型結果較準確地揭示了25 株菌株間的親緣性關系。基于rep-PCR的DiversiLab分型系統，是一種操作簡單、分辨率高、重復性好且高效快速的基因分型方法，可作為食源性病原體檢測及食源性疾病溯源的工具。

DiversiLab分型系統；單增李斯特菌；重復序列PCR；同源性分析

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）全名為單核細胞增生李斯特氏菌，在自然界中廣泛分布，是一種人畜共患的病原菌，也是一種重要的食源性致病菌。據世界衛生組織（World Health Organization，WHO）報告：有4%～8%的水產品，5%～10%的乳及乳制品，15%以上的家禽和30%以上的肉制品被該菌污染［1］。據陳玉貞等［2］報道，食品中李斯特菌的檢出率為8.85%，其中生雞肉為9.54%，生豬肉為24.85%，生羊肉為3.35%，生牛肉為14.47%，散裝熟肉為6.84%，生食蔬菜為1.34%。99%的人類李斯特病被認為是因為食用了被李斯特菌污染的食品而引起的，其臨床癥狀通常表現為腦膜炎、敗血癥、流產、產前感染、腸胃炎和單核細胞增多［3］。在美國每年大約2 500 例的感染是由單增李斯特菌引起的，感染率不是很高，但其死亡率可達20%［4］。其高致病性，在國內外的食品安全檢測中逐漸被重視［5］，并已被WHO列為四大食源性致病菌之一［6］，成為許多國家食品衛生的必檢項目。在我國，單增李斯特菌也被列為21世紀對衛生健康具有重大影響的12 種病原微生物之一［7］，被國家質檢總局列為進出口食品的必檢菌或監控病原菌。

在去過20多年的時間里，分子生物學得到快速發展，基于DNA序列分型的基因分型技術也得到了飛速發展。愈來愈多的分子分型技術被應用于微生物分型［8］，如多位點序列分析、脈沖場凝膠電泳（pulse field gel electrophoresis，PFGE）、擴增片段長度多態性（amplificed fragment length polymorphism，AFLP）、重復序列-聚合酶鏈式反應（repetitive sequence-based polymerase chain reaction，rep-PCR）等。DiversiLab分型系統是基于rep-PCR進行分型的，它是一個高度集成、操作簡便、快速的分型平臺。研究表明DiversiLab分型系統與PFGE分型結果有良好的一致性［9-10］，相比于分型“金標準”的PFGE，它具有更高的重復性，更簡便的操作流程，能夠實現微生物的快速分型［11］，對監測和追溯環境及食品樣品中的病原微生物具有重要意義。本研究的目的在于通過對從同一類食品中分離出的單增李斯特菌進行DiversiLab分型研究，揭示其內在聯系，明確污染源，為將來的食品安全事件和食源性疾病溯源提供科學依據和技術支持。

1　　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源

2001—2010年福建出入境檢驗檢疫局從各類禽肉制品中分離出的單增李斯特菌共有25 株。這25 株菌分別來自9 個不同的城市。來自南平的有3 株，來自蘭州的有7 株，來自哈爾濱的有6 株，來自北京的有4 株，來自桂林、重慶、昆明、成都和西寧的各有1 株。

1.1.2試劑

李斯特菌顯色培養基鄭州博賽生物技術股份有限公司；胰酪胨凍大豆酵母瓊脂廣東環凱微生物科技有限公司；腦心浸液培養基北京陸橋科技有限公司；DNA提取試劑盒（MO BIO UltraCleanTMMicrobial DNA Isoalation Kit）、革蘭氏陽性菌鑒定卡（GP）、DNA Reagents & Supplies、Diversilab Listeria Kit、DNA Chips法國生物梅里埃公司；AmpliTaq DNA聚合酶美國Applied Biosystems公司。

1.1.3儀器與設備

DiversiLab分型系統、VITEK 2 Compact 30全自動微生物鑒定儀法國生物梅里埃公司；ABI 9700聚合酶鏈式反應擴增儀美國Applied Biosystems公司；核酸蛋白測定儀德國Eppendorf公司。

1.2方法

1.2.1菌株的鑒定

2001—2010年福建出入境檢驗檢疫局從各類禽肉制品中分離出的25 株單增李斯特菌，全部按照GB 4789.30—2010《食品微生物學檢驗》方法鑒定為單增李斯特菌后，在VITEK 2 Compact上用GP卡進行鑒定，確定其為單增李斯特菌（表1）。

表1　25 株單增李斯特菌菌株信息詳情Taabbllee 11 　　SSppeecciiffi i cc iinnffoorrmmaattiioonn aabboouutt 2255 ssttrraaiinnss ooff L. monocytogeenneess

1.2.2DNA指紋圖譜分型方法

1.2.2.1DNA的提取

實驗菌株接種到胰酪胨凍大豆酵母瓊脂上，在（36±1）℃條件下，培養24 h后。用DNA提取試劑盒，按照DiversiLab推薦的操作步驟進行DNA提取，用核酸蛋白測定儀將所有樣品的質量濃度調整到25～40 μg/μL。

1.2.2.2PCR擴增

應用DiversiLab Listeria Kit提供的rep-PCR引物進行擴增，反應體系為25 μL：18 μL rep-PCR MM1，2.5 μL 10×PCR buffer，2.0 μL Primer Mix L，0.5 μL Ampli Taq，2.0 μL反應模板。PCR循環條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，70 ℃延伸90 s，35 個循環，最后70 ℃延伸3 min。

1.2.2.3芯片電泳

按照DiversiLab分型步驟，先配制Gel-dye混合物，然后將Gel-dye、DNA Marker、Ladder和PCR擴增產物加載到DNA Chip，最后將加載好的芯片放入Agilent 2100運行。運行后的數據自動上傳至DiversiLab網站。

1.2.2.4分型方法

采用DiversiLab軟件（版本3.4.4）進行分析，用Pearson's Correlation方法來確定距離矩陣、非加權配對算術平均法建立樹狀圖和相似矩陣，進行聚類分析。

對于流行病爆發調查常使用的PFGE分型，已經提出了一組定義菌株關系的指導標準［12］，將菌株間的關系分為：不存在差異、相關以及不同。DiversiLab分型在基于比較rep-PCR和脈沖場凝膠電泳或其他金標準方法的基礎上，將相似度在97%以上的定義為樣品不可區分，即兩個樣品之間沒有帶型差異，模擬電泳條帶沒有強度和單個差異，但整體帶型強度差異可能有；將相似度在95%及以上的定義為樣品具有相關性，即樣品模擬電泳條帶有1～2 條不同；將相似度在95%以下定義為不同樣品，即樣品模擬電泳圖有3 條以上的條帶不同［13-15］。

2　　結果與分析

相似度線：97%。圖 1　　25 株單增李斯特菌的DiversiLab聚類分析圖Fig.1　　Dendrogam analysis and virtual gel images of 25 strains of L. monocytogenes

采用DiversiLab分析軟件進行聚類分析，得到聚類分析圖，如圖1所示。“P”表示相似度為97%及以上的樣品分組，25 株菌被分為11 組（P），P1、P4、P6、P7、P8和P9組中各包含有2 株菌，P11組中有9 株菌，這些組內的菌株其模擬電泳條帶沒有差別，在遺傳水平不可區分；“G”表示相似度為95%及以上的樣品分組，共分為了6 組，G1組內有4 株菌，G2組內有3 株菌，G3組內有6 株菌，G4組內有2 株菌，G6組內有9 株菌，G5組內只有1 株菌，這6 組內樣品間的模擬電泳條帶有1～2 條不同，在遺傳水平上具有相關性。

3　　討 論

食品安全是一全球性問題，由食源性致病菌引起的食品安全問題日益突出，為有效地預防食品安全事件的發生，應對分離出的致病菌進行分型溯源。通常，來自不同區域或不同樣品的同種細菌，表現出的多樣性足以被分為不同的亞型。菌株分型的目的在于回答這樣一個問題，即被鑒定為同一種的兩個微生物菌株在遺傳水平上是否相同，是否具有同源性。

隨著分子生物學技術的快速發展，產生了各種基于不同原理的分型技術。如：PFGE、限制性長度多態性研究、AFLP、rep-PCR等，這些分子分型方法都有各自的局限性［16-18］。被業界公認的分型“金標準”PFGE，也很難解決類似尺度的條帶以及多個實驗室間重復性問題［19］。自動化的DiversiLab分型是基于rep-PCR進行分型的，它有效地解決了非自動化的rep-PCR分型方法實驗室間重復性較低，分型時間較長及基于瓊脂凝膠電泳的分離和檢測都很難達到統一標準的問題。DiversiLab分型方法是一種自動化標準化系統，其結果的收集和處理不受主觀限制，從DNA提取到出分析結果不到24 h，結果具有很高的分辨率，一般條帶能達到10 條左右；標準化的試劑，重復性好，操作簡單，是一種實時定量檢測［20-22］。

本實驗從同一類樣品中分離出的25 株單增李斯特菌，在相似系數為95%時，被分為G1、G2、G3、G4、G5和G6共6 組；在相似系數為97%時，被分為P1～P11共11 組。P組內的菌株不可區分，在模擬電泳條帶上沒有強度和單個差異，但可能有整體帶型強度差異。G組內的菌株具有相關性，在模擬電泳圖上有3 條以上的條帶不同。相似系數大于95%且小于97%的菌株之間具有相關性，這可能是來自同一污染源的菌株發生了變異，在分型上沒有表現出同一性。來自同一地方同一商場的L095 與L096、L099與L102不可區分，并且是來自同一類型同一性狀的食品，表明他們是來自同一污染源。P11組內的9 株菌，有來自同一地方同一商場的，也有來自同一地方不同商場的，還有來自不同地方不同商場的，這些菌株之間不可區分，表明該型的單增李斯特菌株具有流行性，從一個地方傳播到了另外一個地方，這些食品在不同或相同的地方通過不同或相同的途徑污染了相同的單增李斯特菌菌株。

要對食品中分離出的致病菌進行準確的溯源，需要結合多種信息，如：采樣地、生產企業、生產日期、生產批號、物流信息、原材料來源地、菌株分離時間及菌株本身的生理生化特征等多種信息才能準確地得出結論。劉靜宇等［23-24］對食品中分離的金黃色葡萄球菌的分型研究表明，DiversiLab分型結果與樣品的種類、來源及菌株分離時間等信息間有較合理的對應關系和內在聯系，結果準確可靠。本研究中，DiversiLab的分型結果揭示出了菌株之間的親緣性關系，對實現單增李斯特菌的主動監測和傳染源溯源具有指導作用，對控制由單增李斯特菌引起的食源性疾病流行具有十分重要的意義。

自動化的DiversiLab分型系統具有諸多優點，但也有局限性［25］：在進行芯片分析檢測時，只需1 μL樣品，如果操作不小心，產生了氣泡，對結果有嚴重影響，需重新分析，增加了檢測成本和檢測時間；此外，若樣本不足12 個，為形成回路芯片上剩余的孔也必須加入Marker和樣品替代物使其保持與加樣孔的體積一致，造成試劑浪費和成本增加。然而，DiversiLab分型系統的高效率、高分辨率、能建立數據庫的可重復性、實驗室間能比較和高通量的應用以及其基于Web界面的遠程訪問和數據庫共享等優點完全能應用于菌株跟蹤監測，疾病爆發病源調查及食源性致病菌的溯源分析。在日常的菌株跟蹤監測和疾病爆發病原調查中自動化的DiversiLab分型工具將是一種十分有用的工具。

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DiversiLab Typing of Listeria monocytogenes Isolated from Poultry Products

ZHENG Jing1， TANG Zhongwei1，2， CHEN Bin1， HUANG Xiaorong1， LIN Jie1， ZHANG Tiyin1
（1. Fujian Province Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research， Fuzhou350001， China；2. College of Food Science， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou350002， China）

To study the homologous relationship of Listeria monocytogenes strains isolated from poultry products， which can provide a scientifi c basis for forecasting and early warning of food security and provide technical support for preventing food-borne diseases caused by L. monocytogenes. Methods： A total of 25 strains of L. monocytogenes isolated from the poultry products in the Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau from 2001 to 2010 were typed by DiversiLab typing system through DNA extraction， repetitive sequence-based polymerase chain reaction （rep-PCR）， and microfl uidic chip. Results： At the similarity coefficient of 95% and 97%， 25 strains were accordingly divided into 6 groups （G） and 11 patterns （P）， respectively. Conclusions： The genetic relatedness among the 25 strains could be accurately revealed by DiversiLab typing. Automated DiversiLab typing system is a fast， easily operated， highly discriminatory and effi cient genetyping method. It can be recommended as an epidemiological analysis tool for foodborne illness.

DiversiLab typing system； Listeria monocytogenes； rep-PCR； epidemiological analysis

Q936

A

1002-6630（2015）24-0220-04

10.7506/spkx1002-6630-201524041

2015-06-27

福建省自然科學基金項目（2010J01266）；國家質檢總局科技計劃項目（2010IK169）

鄭晶（1973—），女，研究員，本科，研究方向為食品中微生物檢測。E-mail：fjciqzj@qq.com