沙門氏菌核酸檢測試劑盒的評價

邵碧英，董 建，陳 彬，陳文炳，黃曉蓉，鄭 晶，繆婷玉，彭 娟

（福建出入境檢驗檢疫局 福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福建 福州　　350 001）

沙門氏菌核酸檢測試劑盒的評價

邵碧英，董 建，陳 彬，陳文炳，黃曉蓉，鄭 晶*，繆婷玉，彭 娟

（福建出入境檢驗檢疫局 福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福建 福州350 001）

采用室內技術參數驗證和協同實驗的方式對商品化沙門氏菌核酸檢測試劑盒在食品中沙門氏菌核酸檢測上的包容性、排他性、靈敏度、特異性、準確度、檢測限、耐變 性、批間變異進行評價。評價結果表明，試劑盒檢測結果與國家標準方法檢測結果總體上無顯著差異，能滿足食品樣品的檢測要求；但對蔬菜制品的靈敏度較其他食品低，與國家標準方法有顯著差異，因此該商品化試劑盒不適用于蔬菜制品中沙門氏菌核酸的檢測。

沙門氏菌；核酸檢測試劑盒；環介導等溫擴增；評價

沙門氏菌是最常見的食源性致病菌，傳統的檢驗方法往往需要花費很長的時間。許多快速、靈敏的分子生物學方法已被應用于食品微生物的快速檢驗，克服了傳統檢驗方法的缺陷，其中聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）已成為最普遍的食品微生物分子生物學檢驗方法。近年來，在PCR技術基礎上又出現了新的技術，如環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術。LAMP技術具有簡便、高效、特異、快速等優點，在食品中過敏原［1-2］、轉基因成分［3-5］、致病菌［6-21］的篩選檢測上已得到較廣泛的應用。市場上也出現了相關的商品化LAMP檢測試劑盒，如由廣州華峰生物科技有限公司生產的沙門氏菌核酸檢測試劑盒就是應用LAMP法檢測食品中的沙門氏菌核酸。而這些商品化檢測試劑盒是否真正滿足日常檢測的需求，還需經過實驗室評價。本實驗室已開展了Easy TestTM菌落總數測試片［22］、3M PetrifilmTM金黃色葡萄球菌檢驗測試片［23］的評價實驗，本實驗在此基礎上，根據SN/T 2775—2011《商品化食品檢測試劑盒評價方法》［24］和SN/T 3256—2012《食品微生物檢驗方法確認技術規范》［25］的要求，以GB 4789.4—2010《食品微生物學檢驗：沙門氏菌檢驗》［26］為參考方法，研究建立了對廣州華峰生物科技有限公司生產的沙門氏菌核酸檢測試劑盒的評價方案，并進行了評價實驗，以評估其在食品檢測中的準確性和適用性，為更加準確和規范地使用該商品化試劑盒、進一步制定標準提供一定的參考依據。

1　　材料與方法

1.1材料與試劑

沙門氏菌標準菌株、參照菌株、實驗室分離菌株、非沙門氏菌的標準菌株、供試食品樣品由本單位微生物實驗室保存；沙門氏菌核酸檢測試劑盒［批號分別為Sal11121303、Sal12041702（R）、Sal11122202］由廣州華峰生物科技有限公司提供，除批間變異用3 個批號外，其他試驗均用批號為Sal12041702（R）的試劑盒；GB 4789.4—2010所需培養基和試劑北京陸橋技術有限責任公司。

1.2儀器與設備

Stomacher 3500型拍擊式均質器英國Seward公司；BD115型恒溫培養箱德國Binder公司；MIKRO120型臺式高速離心機德國Hettich公司；2004型水浴鍋常州國華電器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌懸液的制備

將沙門氏菌標準菌株、參照菌株、實驗室分離菌株，非沙門氏菌的標準菌株分別活化后接種于營養肉湯中，37 ℃培養18～24 h。

1.3.2包容性和排他性的測試

包容性是指確定某一檢測方法從眾多菌中檢測到目標菌的能力，選擇100 株沙門氏菌的純化菌株，用核酸檢測試劑盒法進行測試。排他性是指某一檢測方法對可能引起交叉反應的相關非目標菌株的抗干擾能力，選擇30 株非沙門氏菌的純化菌株，用核酸檢測試劑盒法進行測試。核酸檢測試劑盒測試按照說明書進行，呈橘色的即為陰性結果，呈綠色的即為陽性結果。

1.3.3準確度、特異性、靈敏度及檢測限的測試

參照文獻［25］，選擇家禽類、魚類和海產品、蔬菜制品、乳制品、雜品共5 類15 種代表性食品作為驗證基質。將腸炎沙門氏菌（ATCC13076）培養液適當稀釋后，分別制備未接種（L0）、低濃度（L1）、高濃度（L2）3 個污染水平實驗樣品，低濃度（L1）、高濃度（L2）兩個水平之間相差10 倍，分別用核酸檢測試劑盒和參考方法進行測試，均進行20 個平行。對數據進行統計分析。

相對準確度：相同的樣品用核酸檢測試劑盒法和參考方法測試結果的一致程度，即LAMP方法和參考資料方法均確證為陽性的數量與均確證為陰性的數量之和除以用于確證的樣品總數。

相對特異性：核酸檢測試劑盒法和參考方法均確證為陰性的總數除以參考方法確證為陰性的總數。

相對靈敏度：核酸檢測試劑盒法和參考方法均確證為陽性的數量除以參考方法確證為陽性的總數。

檢出限：當檢出概率＞0.5時，25 g基質中的菌含量即為方法的檢出限。檢出概率為檢出陽性結果占所有檢測結果的比率，即：檢出概率=x/N，式中：x為檢出陽性結果次數；N為測定總次數。

1.3.4耐變性的測試

分別取非目標菌（肺炎克雷伯氏菌46117），高濃度、低濃度目標菌（腸炎沙門氏菌ATCC13076）菌懸液，對核酸檢測試劑盒法的反應溫度（正常設置為65 ℃）和反應時間（正常設置為60 min）2 個變量進行耐變性實驗。每個變量取2 個不同的水平，反應溫度取65 ℃和60 ℃，反應時間取65 min和55 min。2 個變量進行兩兩組合，每個組合進行10 個平行。

1.3.5批間變異的測試

取純培養的1 株目標菌（腸炎沙門氏菌ATCC13076）、1 株非目標菌（肺炎克雷伯氏菌46117）的菌懸液，分別用3 個不同批號的沙門氏菌核酸檢測試劑盒進行檢測，比較結果，以測試試劑盒的批間變異、穩定性。

1.3.6室間協同實驗

以牛乳為基質，添加腸炎沙門氏菌培養液，制備成未接種（L0）、低濃度（L1）、高濃度（L2）3個接種水平的凍干樣品，發送8 家實驗室進行協同實驗。每一接種水平的樣品同時用核酸檢測試劑盒法和參考方法進行測試，均做8 個平行，比較2 種方法的結果。

2　　結果與分析

2.1包容性和排他性的測試結果

選擇100 株經確認的沙門氏菌標準菌株（6 株）、參照菌株（5 株）和實驗室分離菌株（89 株），用核酸檢測試劑盒進行測試，結果全部為陽性，表明該試劑盒在包容性上表現良好。

選擇30 株經確認的非沙門氏菌的標準菌株，用核酸檢測試劑盒進行測試，結果全部為陰性，表明該試劑盒在排他性上表現良好。

2.2準確度、特異性、靈敏度及檢測限的測試結果測試結果如表1所示，數據分析結果如表2所示。與參考方法相比，該核酸檢測試劑盒對家禽食品的相對準確度、相對特異性、相對靈敏度均較好，試劑盒方法檢出限為1.12 CFU/g；對魚類和海產品的相對準確度、相對特異性、相對靈敏度均較好，試劑盒方法檢出限為

表1　　15 個食品類型的實驗結果Table 1　　Test results for 15 kinds of food samples

表2　相對準確度、特異性、靈敏度及檢出限統計分析結果TTaabbllee 22 　　SSttaattiissttiiccaall aannaallyyssiiss ooff rreellaattiivvee aaccccuurraaccyy， ssppeecciiffi i cciittyy，sensitivity and limit of detection

1.12 CFU/g；對蔬菜制品的相對靈敏度較差，試劑盒方法在1.12 CFU/g污染水平不能有效檢出；對乳制品的相對準確度、相對特異性、相對靈敏度均較好，試劑盒方法檢出限為0.11 CFU/g；對雜品類食品的相對準確度、相對特異性、相對靈敏度均較好，試劑盒方法檢出限為

1.12 CFU/g。

2.3耐變性的測試結果核酸檢測試劑盒說明書上所用的條件為：65 ℃、

表3　　耐變性測試結果Table 3　　Results of stability test

60 min，分別對反應溫度和反應時間2 個變量進行耐變性實驗，結果如表3所示。檢測結果表明，該試劑盒在反應溫度65 ℃、反應時間55 min和反應溫度60 ℃、反應時間

65 min的實驗條件下操作較為適宜。在65 ℃、65 min的條件下，反應時間超過了說明書規定的時間，就會出現假陽性結果。在60 ℃、55 min的條件下，反應溫度低于說明書規定的適宜溫度，就會出現假陰性結果。因此超出試劑盒說明書規定的反應溫度或反應時間，會出現假陽性或假陰性結果。

2.4批間變異的測試結果

表 4　　批間變異測試結果Table 4　　Results of inter-batch variations

取3 個不同批號的試劑盒對目標菌（腸炎沙門氏菌ATCC13076）和非目標菌（肺炎克雷伯氏菌46117）進行批間變異實驗，測試結果如表4所示。結果表明，該試劑盒的批間總體差異較小，但個別出現假陽性和假陰性的結果。

2.5協同實驗的測試結果

8 家實驗室對3 個接種水平樣品的測試結果如表5所示，統計結果如表6所示。結果分析表明2 種方法無顯著差異且方法穩定可靠。

表5　　協同實驗結果Table 5　　Results of collaboration test

表6　協同實驗的統計結果TTaabbllee 66 　　SSttaattiissttiiccaall aannaallyyssiiss ooff ccoollllaabboorraattiioonn tteesstt

3　　結 論

本實驗參考SN/T 2775—2011［24］和SN/T 3256—2012［25］

制訂的評價實驗方案對廣州華峰生物科技有限公司生產的沙門氏菌核酸檢測試劑盒開展相關技術參數的驗證，評價結果表明，試劑盒檢測結果與國家標準方法［26］

檢測結果總體上比較無顯著差異，能滿足食品樣品的檢測要求；但蔬菜制品的靈敏度較其他食品低，與國家標準方法有顯著差異，因此不適用于檢測蔬菜制品。沙門氏菌LAMP檢測方法具有快速、簡便、靈敏的特點，無需使用大型儀器設備，適用于食品中沙門氏菌的快速篩查檢測，適合在基層實驗室推廣應用。

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Evaluation of Salmonella Nucleic Acid Detection Kit

SHAO Biying， DONG Jian， CHEN Bin， CHEN Wenbing， HUANG Xiaorong， ZHENG Jing*， MIAO Tingyu， PENG Juan
（Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research，Fujian Province Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Fuzhou35000 1， China）

The inclusiveness， exclusivity， sensitivity， specificity， accuracy， limit of detection （LOD）， resistance to denaturation and batch variation of the commercial Salmonella nucleic acid detection kit used to detect Salmonella in food samples were evaluated based on indoor technical parameters by validation and collaboration test. Results showed that the kit was not signifi cantly different from the national standard method in general， and could meet the requirements of food sample testing. However， the sensitivity for vegetables products was lower than those of other foods， which signifi cantly differed from the national standard method. Thus the commercial kit was not suitable for detection of Salmonella in vegetable products.

Salmonella； nucleic acid detection kit； loop-mediated isothermal amplifi cation； evaluation

Q93.33

A

1002-6630（2015）24-0242-04

10.7506/spkx1002-6630-201524045

2015-06-29

福建省科技計劃項目（2011Y0002）；國家認監委出入境檢驗檢疫行業標準制（修）訂計劃項目（2013B264K）作者簡介：邵碧英（1973—），女，研究員，博士，研究方向為食品生物學分子檢測。E-mail：byshao@sohu.com

鄭晶（1973—），女，研究員，碩士，研究方向為食品微生物檢驗。E-mail：fjciqzj@qq.com