酶標抗原直接競爭ELISA檢測食品中氟喹諾酮類藥物多殘留

樊曉博，謝蘭心

（渭南職業技術學院 渭南市農產品食品檢驗檢測研究中心，陜西 渭南　　714000）

酶標抗原直接競爭ELISA檢測食品中氟喹諾酮類藥物多殘留

樊曉博，謝蘭心

（渭南職業技術學院 渭南市農產品食品檢驗檢測研究中心，陜西 渭南714000）

固相包被恩諾沙星抗體，辣根過氧化物酶標記的抗原與標準品（或樣品）中氟喹諾酮藥物競爭結合抗體，建立了高效、高靈敏的氟喹諾酮藥物直接競爭酶聯免疫吸附分析檢測方法。優化反應條件后，得到方法的IC50為2.04 μg/L，靈敏度為0.15 μg/L，線性范圍0.3～15 μg/L；方法可以檢測12 種氟喹諾酮藥物，在生乳、雞肉、魚肉和蝦肉4 種樣品中12 種藥物的回收率為70%～121.5%。

氟喹諾酮；酶標抗原；多殘留檢測；直接競爭酶聯免疫吸附分析

氟喹諾酮類（fluoroquinolones，FQs）藥物，為廣譜性動物抗生素，主要包括環丙沙星、恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）、諾氟沙星等，此類藥物殺菌活力強，具有高效、毒副作用小、不易產生耐藥性等優點［1-2］。近年來，FQs藥物在畜牧和水產養殖中廣泛應用，造成動物食品原料的藥物殘留日益嚴重［3］。此類藥物具有良好的脂溶性，會損害中樞神經系統，并引起過敏反應和肝臟毒性［4-5］。因此，歐盟對食品中FQs殘留限量做了嚴格的規定，我國農業部也針對該類藥物制定了相關的標準［6-8］。

目前，動物性食品中FQS的檢測方法主要有分子印跡-固相萃取法［9］、毛細血管法［10］、高效液相法［11-13］、液相色譜-質譜聯用法［14-16］等。儀器法檢測準確、可靠，但儀器設備昂貴，前處理和操作復雜，一般僅作為可疑樣品的驗證，不適用于大批量樣品篩查。而免疫學方法特異性強，操作簡單、快速、經濟，能夠適用于大通量樣品的檢測。近年來，酶聯免疫吸附（enzyme-linked immunoassay，ELISA）分析方法成為檢測動物性食品中藥物殘留的研究熱點［17］。檢測FQS的ELISA方法從單個藥物殘留的檢測［18-20］逐漸發展到多藥物殘留免疫檢測［21-22］，多殘留檢測依靠抗體對藥物具有廣泛的交叉反應來實現［23-24］。本研究在單克隆抗體的基礎上，標記抗原，優化提取方法，建立直接競爭ELISA方法，檢測動物食品中至少12 種FQS藥物殘留，為動物食品的安全提供更加有效的技術保障。

1　　材料與方法

1.1材料與試劑

ENR、環丙沙星、培氟沙星、諾氟沙星、單諾沙星、氧氟沙星、惡喹酸、氟甲喹、加替沙星、洛美沙星、依諾沙星、氟羅沙星、左氧氟沙星、色拉沙星、萘啶酸標準品、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）美國Sigma公司；ENR-卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、抗ENR單克隆抗體本實驗室自制；96孔微量反應板美國雷博公司；其他化學試劑均為國產市售分析純。

1.2儀器與設備

恒溫培養箱美國Shell Lab公司；P200微量可調移液槍法國吉爾森公司；Wellwash MK-2洗板機、MK-3 ELISA檢測儀美國Thermo公司；恒溫振蕩器上海智城分析儀器制造有限公司；1-13型快速離心機美國Sigma公司；DC-12型水浴氮吹儀上海安普科學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1ENR-OVA酶標記物的制備［25］

溶解5 mg HRP于1 mL、0.2 mol/L醋酸鹽緩沖液中（pH 5.6）中，加入新配制的0.1 mol/L過碘酸鈉溶液0.5 mL，置4 ℃冰箱反應30 min。反應完后加0.5 mL 2.0%的乙二醇溶液，4 ℃反應30 min。向活化的酶溶液中加入0.5 mL、3 mg/mL ENR-OVA（20%甲醇溶液溶解）溶液混勻，于4 ℃先用蒸餾水透析2次，再換用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）透析2 d。透析完畢后取出，3 000 r/min離心30 min，除去沉淀，上清液即為酶標記物。

1.3.2固相包被抗體制備

將單克隆抗體用碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）稀釋至適宜質量濃度，96 孔微孔板每孔中各加入200 μL，37 ℃放置過夜，棄去包被液，加入封閉液，每孔220 μL，封閉3 h。棄去封閉液，烘干，備用。

1.3.3酶標記物效價測定

將標記好的酶標記物從稀釋度1∶100開始倍比稀釋，包被抗體板條中每孔依次加入100 μL倍比稀釋的酶標記物，室溫避光反應1 h，加入顯色液100 μL反應20 min，終止后，在波長450 nm處測定每孔吸光度。以蒸餾水為空白對照。

1.3.4反應條件優化

將單克隆抗體以1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶12 000、1∶16 000五種稀釋度包被，加入100 μL標準品和100 μL ENR-OVA酶標記物，確定最佳包被稀釋度。用最佳包被稀釋度包板，加入100 μL標準品和100 μL質量濃度為0.1、0.3、0.6、0.9、1.2 mg/L的酶標記物，確定最佳的酶標記物質量濃度。

1.3.5直接競爭ELISA操作步驟

取包被好的板條，加入100 μL標準品（或處理好的樣品）到相應的微孔中，加入分析緩沖液稀釋的酶標記物100 μL，室溫避光反應50 min，將微孔中的反應液甩掉，再將清洗液加滿每一微孔后甩掉，重復洗3次。在每一微孔加入底物溶液100 μL后，在室溫條件下避光靜置20 min。每一微孔加入100 μL反應終止液，酶標儀以單波長450 nm或雙波長450 nm/650 nm判讀。

1.3.6樣品處理

生乳：取4 mL待測生乳加入50 μL 3 mol/L鹽酸，振蕩混合后，3 000 r/min離心15 min，取澄清液以0.01 mol/L磷酸鹽（pH 7.4）稀釋3 倍后檢測。

組織樣品（雞肉、豬肉、魚、蝦）：將1 g已均質樣品放入15 mL離心管中，再加入3 mL 80%甲醇溶液，振蕩混合約1 min，再以上下轉動充分混合約10 min。3 000 r/min離心15 min，取1 mL上層液于玻璃管中，50 ℃條件下利用氮氣將有機溶劑吹干。向玻璃管中加入0.5 mL、4%甲醇溶液，先將殘余物完全溶解，再加入正己烷1 mL，振蕩混合約20～30 s。3 000 r/min離心15 min，利用吸管吸去包含中間乳化層部分的上層液（正己烷），再吸取下層液檢測。1.3.7考核指標

靈敏度：測定IC10得到最低檢測限，確定體系線性檢測范圍（IC20～IC80）［26］。

式中：B為標準溶液或樣本溶液的平均吸光度；B0為質量濃度為0時的平均吸光度。

特異性：將FQs各種藥品配成不同質量濃度的溶液作為待測樣品，采用ELISA方法檢測，按式（2）計算交叉反應率。

回收率：向各種陰性樣品中分別添加不同質量濃度的FQS標準品，處理后用ELISA方法檢測，每個質量濃度作3 個平行測定。

1.3.8與拜發R-Biopharm氟喹諾酮試劑盒的對比

選擇本方法與對照試劑盒均可以檢測的FQs藥物，針對這些藥物選擇相同的樣品用2 種方法同時測定，以拜發試劑盒檢測結果為基準計算回收率，判斷其相關性。

2　　結果與分析

2.1酶標記物效價

由圖1可知，酶標記抗原后，酶的活性仍很高，酶標記物的效價達到102 400以上，可以滿足反應體系的質量濃度要求，表面酶標記物制備成功。

圖 1　酶標記物效價曲線Fig.1　The titer curve of HPR-ENR-OVA

2.2反應條件優化

抗原和抗體的質量濃度對免疫檢測方法的靈敏度和特異性有重要的影響，因此有必要對合適的抗體和抗原的質量濃度進行探索。

2.2.1包被緩沖液的優化

不同pH值的緩沖體系對包被效果有很大的影響。以最高吸光度（Amax）、IC50和Amax/IC50為綜合參考指標，對比0.05 mol/L、pH 9.6碳酸鹽緩沖液、0.05 mol/L、pH 7.6磷酸鹽緩沖液和0.05 mol/L、pH 7.6 Tris-鹽酸緩沖液3 種包被液的包被效果。由表1可知，pH 9.6的碳酸鹽緩沖液作為包被液時，與其他2 種緩沖液相比，Amax最大，IC50最小，體系的靈敏度最高，因此選擇0.05 mol/L、pH 9.6碳酸鹽緩沖液作為抗體包被液。

表1　　包被液的優化Table 1　　Optimization of coating buffer

2.2.2最佳抗體稀釋度的確定

圖 2　包被抗體稀釋度曲線Fig.2　Dilution curve of antibody by dc-ELISA

Amax與包被抗體質量濃度呈正比，抗體質量濃度過高時，抗體與抗原結合過多，方法的靈敏度下降。由圖2可知，當抗體稀釋度為1∶12 000時，表示靈敏度的Amax/IC50數值最大，IC50最低，說明靈敏度最高，其Amax也在適宜的范圍內，所以選擇包被抗體的稀釋度為1∶12 000。

2.2.3最佳酶標抗原質量濃度確定

圖3　ENR-OVA酶標抗原質量濃度曲線Fig.3　Selection of optimal HRP-ENR-OVA concentration by dc-ELISA

選擇包被抗體稀釋度為1∶12 000，選擇不同質量濃度的酶標抗原做直接競爭ELISA實驗，結果如圖3所示。隨著酶標抗原的質量濃度降低，Amax隨之下降，在酶標抗原質量濃度為0.6 mg/L時，Amax/IC50最大，IC50最小，此質量濃度條件下體系的靈敏度最高，Amax在合適的范圍內。故選擇此質量濃度為最佳的酶標抗原質量濃度。

2.2.4甲醇體積分數對反應的影響

圖 4　甲醇體積分數對dc-ELISA的影響Fig.4　Infl uence of methanol concentration on dc-ELISA

有機溶劑會對反應體系中抗原抗體結合產生影響，實驗中使用甲醇作為提取溶劑，因此需考察其體積分數對整個反應體系靈敏度的影響。由圖4可知，當甲醇體積分數不超過4%時，對體系的Amax與IC50均沒有顯著的影響，當甲醇體積分數超過8%后，Amax與IC50都開始逐漸上升，體系靈敏度下降，因此，在樣品檢測中使用4%的甲醇溶液。

2.3ELISA方法考核

2.3.1方法靈敏度

在優化的條件下以ENR標準溶液質量濃度（0、0.1、0.3、1.1、3.3、10、30 μg/L）的對數值做橫坐標，以抑制率為縱坐標繪制標準曲線，得到曲線方程為y=61.443 34－35.845 76x，R2=0.993 9。在一系列條件優化基礎上，ELISA方法的靈敏度（IC10）為0.15 μg/L，IC50為2.04 μg/L，線性關系良好，線性檢測范圍為0.3～15 μg/L。

2.3.2方法的特異性

表2　　交叉反應率Table 2　　Cross-reactivity of antibody against FQs

將FQs的各種藥物物配成不同質量濃度的溶液作為被測物，采用ELISA方法測定。如表2所示，dc-ELISA方法具有廣泛的交叉反應，與環丙沙星、培氟沙星等8 種交叉反應率超過50%，檢測體系可以靈敏地檢測出動物食品中此類的藥物殘留；加替沙星、洛美沙星等4 種藥物的交叉反應率在15%～47%之間，可在中質量濃度時檢測藥物殘留；左氧氟沙星、色拉沙星、萘啶酸3 種藥物交叉反應率較低，在實驗室條件下未進行檢測，但鑒于畜牧水產養殖時使用FQs藥物質量濃度較高，因此本檢測體系具有非常廣泛的檢測范圍，可以實現藥物殘留的廣譜檢測。

2.3.3方法的回收率

ELISA的批內和批間差異均低于10%。加標回收實驗室評價ELISA檢測方法準確度的一個重要指標。選擇生乳、雞肉、魚肉和蝦肉等常規檢測樣品進行添加回收率測定，選取ENR、環丙沙星等交叉反應率較高的9 種藥物添加質量濃度梯度進行檢測，添加質量濃度為2、6、15 μg/L三個水平，對交叉反應率相對較低的3 種藥物添加高質量濃度，添加質量濃度為20 μg/L，根據1.3.6節的方法進行樣品處理計算不同水平的回收率。由表3可見，12 種FQs藥物的回收率在70%～121.5%之間，變異系數（coeffi cient of variation，CV）在3.7%～9.7%之間，說明該方法重復性好、精確度高，用于樣品分析準確、可靠。

表3動物食品樣品添加回收率（n==33）

TTaabbllee 33 RReeccoovveerriieess ooff ffl l uuoorrooqquuiinnoolloonneess ssppiikkeedd iinnttoo aanniimmaall--ddeerriivveedd food sampleess （n == 33）

藥物名稱添加量/ （μg/L）生乳　　　雞肉　　　魚肉　　　蝦肉測定值/ （μg/L）回收率/%　　CV/%　　測定值/ （μg/L）回收率/%　　CV/%　測定值/ （μg/L）回收率/%　　CV/%　測定值/ （μg/L）回收率/%　　CV/% ENR 2　1.7　85.0　8.6　2.21　110.5　7.6　2.43　121.5　9.7　1.87　93.5　8.6 6　5.2　86.6　7.8　6.19　103.0　5.8　6.1　101.6　6.4　5.39　89.8　7.5 15　14.2　94.7　9.4　17.2　114.6　6.3　16.9　112.0　9.3　13.9　92.6　9.3環丙沙星2　2.1　105.0　7.3　2.3　115.0　8.5　2.2　110.0　8.5　1.97　98.5　7.4 6　5.7　95.0　8.5　6.36　106.0　6.9　5.9　98.3　7.3　5.14　85.6　5.9 15　16.1　107.0　5.2　15.8　105.0　9.6　16.4　109.3　5.9　14.2　94.6　8.6培氟沙星2　1.58　79.0　6.4　1.73　86.5　8.8　1.69　84.5　9.5　1.45　72.5　6.4 6　4.9　81.6　8.9　4.97　82.8　7.3　4.79　79.8　9.4　4.75　79.2　7.8 15　13.6　90.6　7.8　12.9　86.0　5.6　13.1　87.3　7.5　11.8　78.6　5.3諾氟沙星2　1.55　77.5　8.2　1.49　74.5　4.9　1.48　74.0　8.7　1.42　71.0　9.2 6　4.25　70.8　4.3　5.27　87.8　7.4　5.16　86.0　6.5　4.38　73.0　7.7 15　13.2　88.0　3.7　11.6　77.3　5.6　12.4　82.6　9.4　12.6　84.0　8.5單諾沙星2　1.47　73.5　6.7　1.46　73.0　7.3　1.4　70.0　6.8　1.62　81.0　9.6 6　4.98　83.0　5.9　4.39　73.2　8.6　4.75　79.2　9.4　4.78　79.6　4.7 15　13.8　92.0　6.8　12.3　82.0　8.9　12.6　84.0　9.2　13.8　92.0　6.4氧氟沙星2　1.46　73.0　7.5　1.58　79.0　7.2　1.57　78.5　8.7　1.53　76.5　8.5 6　4.55　75.8　8.3　4.78　79.6　6.4　4.67　77.8　7.3　4.48　74.6　7.2 15　11.1　74.0　9.9　12.1　80.6　6.9　11.5　76.6　7.8　13.2　88.0　5.8惡喹酸2　1.4　70　6.8　1.48　74.0　8.9　1.56　78.0　5.6　1.48　74.0　8.6 6　4.42　73.6　7.6　4.67　77.8　10　4.77　79.5　8.9　4.39　73.2　7.5 15　12.2　81.0　8.5　11.9　79.3　8.7　12.9　86.0　7.6　12.7　84.7　9.4氟甲喹2　1.52　76.0　5.9　1.53　76.5　9.3　1.48　74.0　7.8　1.53　76.5　5.8 6　4.87　81.1　4.7　4.74　79.0　7.6　4.55　75.8　8.4　4.93　82.2　9.7 15　11.3　75.3　6.1　11.6　77.3　8.4　12.8　85.3　9.1　11.8　78.7　9.3加替沙星2　1.45　72.5　7.3　1.56　78.0　9.6　1.48　74.0　9.6　1.62　81.0　4.8 6　4.36　72.6　8.2　4.77　79.5　8.5　4.32　72.0　8.5　4.98　83.0　6.5 15　12.4　82.6　7.6　11.2　74.6　9.2　11.6　77.3　6.5　12.7　84.7　8.4諾美沙星　　20　17.8　89.0　4.8　16.9　84.5　7.6　15.9　79.5　7.9　18.3　91.5　6.9依諾沙星　　20　17.2　86.0　9.2　17.5　87.5　5.5　17.3　86.5　8.4　17.5　87.5　8.9氟羅沙星　　20　16.8　84.0　8.2　16.2　81.0　8.9　16.1　80.5　5.7　17.2　86.0　7.4

2.3.4與拜發R-Biopharm氟喹諾酮試劑盒的對比

表 4　2 種ELISA方法比較（n==33）Taabbllee 44 　　CCoommppaarriissoonn ooff tthhee rreessuullttss oobbttaaiinneedd ffoorr cchhiicckkeenn aanndd sshhrriimmpp with two different ELISA kits （n == 33）

參考拜發氟喹諾酮試劑盒的檢測參數，選擇ENR、環丙沙星、培氟沙星、氧氟沙星、氟甲喹作為檢測藥物，2 種方法同時檢測含有5 種FQs藥物的雞肉和蝦肉樣品同時進行測定，設置兩個質量濃度水平。如表4所示，以進口試劑盒測定的藥物質量濃度為基準，2 種檢測樣品中5 種藥物的回收率在84.7%～104.7%之間，2 種方法之間有很高的相關性，建立的方法檢測結果準確、可靠，可以作為動物食品樣品中FQs藥物殘留的定量檢測方法。

3　　結 論

本研究利用HRP成功標記了抗原，標記后酶標記物的效價可以滿足檢測要求，建立了直接競爭氟喹諾酮ELISA分析方法。該方法在優化體系條件后，檢測線性范圍為0.3～15 μg/L，最低檢測限為0.15 μg/L，IC50為2.04 μg/L，抗體對15 種FQs藥物具有交叉反應，對其中至少12 種FQs藥物可以進行準確的檢測，4 種動物食品樣品中回收率在70%～121.5%之間。相比現有的ELISA檢測方法，本方法檢測速度快、靈敏度和穩定性有了明顯的提高，藥物檢測范圍廣。與進口試劑盒進行比較，檢測結果準確可靠，可以滿足現有的檢測需要，具有良好的應用前景。

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Direct Competitive ELISA with HRP-Labeled Antigen for Multiresidue Determination of Fluoroquinolones in Animal-Derived Food

FAN Xiaobo， XIE Lanxin
（Weinan Testing and Inspection and Research Center of Agricultural Products and Food，Weinan Vocational and Technical College， Weinan714000， China）

In this study， a rapid and high sensitive direct competitive enzyme-linked immunoassay （dc-ELISA） method based on antigen labeled by horseradish peroxidase （HRP） was established and successfully applied to detect fl uoroquinolones （FQs）in animal-derived food. In the direct competitive assay， monoclonal antibody was bound to the surface of a microtiter plate，and the standards （or the sample） competed with antigen for the antibody binding sites. Under optimized assay conditions，the IC50of dc-ELISA was 2.04 μg/L， the limit of detection was 0.15 μg/L， and the linear range was 0.3-15 μg/L. This method could detect 12 kinds of FQs with recoveries from milk， chicken， fi sh and shrimp in the range from 70% to 121.5%. Key words: fl uoroquinolones； horseradish peroxidase （HRP）-labeled antigen； multiresidue determination； direct competitive ELISA （dc-ELISA）

TS207.3

A

1002-6630（2015）24-0265-05

10.7506/spkx1002-6630-201524049

2015-03-02

渭南職業技術學院青年科研基金項目（WZYQ201405）

樊曉博（1984—），女，講師，碩士，研究方向為食品快速檢測技術。E-mail：shine2786@163.com