超高效液相色譜串聯質譜法直接測定嬰幼兒乳粉中牛磺酸

陳曉峰，周 圍*，解迎雙

（1.西北師范大學地理與環境科學學院，甘肅 蘭州　　730070；2.甘肅出入境檢驗檢疫局綜合技術中心，甘肅 蘭州　　730010）

超高效液相色譜串聯質譜法直接測定嬰幼兒乳粉中牛磺酸

陳曉峰1，周 圍2，*，解迎雙2

（1.西北師范大學地理與環境科學學院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅出入境檢驗檢疫局綜合技術中心，甘肅 蘭州730010）

采用超高效液相色譜串聯質譜技術，以嬰幼兒乳粉中的牛磺酸為研究對象，從樣品處理方法，基質效應以及影響電噴霧離子源的電離因素3 個方面進行優化，建立了一個樣品處理簡單、快捷，基質效應低，靈敏度高的檢測方法。結果表明，方法的回收率在72%～97%之間，相對標準偏差為2.16%～3.33%。該方法的儀器檢出限為50 μg/L，方法檢出限為1 mg/L，應用外標法定量，能夠達到歐盟及我國嬰幼兒乳粉中牛磺酸的檢測要求。整個分析過程在8 min內完成，適合于大批量檢測嬰幼兒乳粉中牛磺酸的測定。

超高效液相色譜串聯質譜；基質效應；嬰幼兒乳粉；牛磺酸

牛磺酸又稱α-氨基乙磺酸，最早由牛黃中分離出來，化學性質穩定，是一種含硫的非蛋白氨基酸，適量的牛磺酸促進機體的激素分泌，增強和改善機體的各種功能，牛磺酸是調節機體正常活動的活性物質，而缺乏牛磺酸會導致多種疾病的發生［1-3］。近年來，牛磺酸被添加在嬰幼兒乳粉中，以期達到補充機體氨基酸的作用。我國在GB 10765—2010《嬰兒配方食品》中明確規定牛磺酸的限量最高值不得超過0.130 mg/g［4-7］，歐洲共同體委員會則建議嬰幼兒乳粉中牛磺酸的含量不得超過12 mg/100 kcal（約400 mg/100 g）［8］。因此測定乳粉中牛磺酸的含量具有重要意義。

目前，國內外測定嬰幼兒乳粉中牛磺酸的方法主要有滴定法［9-10］、比色法［11］、薄層掃描法［12-13］、高效液相色譜法［14-17］和高效液相色譜串聯質譜法［18-19］等。其中滴定法、比色法和薄層掃描法容易受氨基酸的干擾，誤差相對較大；高效液相色譜法不能直接對牛磺酸進行測定，需要利用柱前或柱后衍生進行檢測，操作較為繁瑣，重復性差［20］。本研究采用超高效液相色譜串聯質譜對乳粉中的牛磺酸直接進行檢測，具有高選擇性、樣品處理簡單快速、高靈敏度、抗干擾性強和自動化程度高等優點，實驗結果達到滿意效果。

1　　材料與方法

1.1材料與試劑

亞鐵氰

化鉀、硫酸鋅、乙酸鋅（均為分析純）天津市大茂化學試劑廠；乙腈（色譜純）德國Merck公司；乙酸胺（色譜純）天津市登峰化學試劑廠；牛磺酸標準品農業部環境保護科研監測所。

1.2儀器與設備

TE124S分析天平（感量：±0.1 mg）德國Sartorius公司；BL310百分之一天平（感量：±0.01 g）北京賽多利斯儀器系統有限公司；MS3 Digital渦旋儀德國Ikams公司；3K30離心機美國Sigma公司；SK8200H超聲清洗儀上海科導超聲儀器有限公司；ZWF334振蕩儀上海智城分析儀器制造有限公司；移液槍德國Eppendorf公司；1290-6460超高效液相色譜-質譜聯用儀（配有電噴霧離子源）美國Agilent公司。

1.3方法

1.3.1液相色譜條件

ACQUITY BEHTMHILIC色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：A：50 mmol/L乙酸銨溶液，B：乙腈；進樣量0.5 μL；柱溫30 ℃；流速0.3 mL/min梯度洗脫，見表1。

表1　　液相色譜梯度洗脫程序表Table 1　　LC gradient elution program

1.3.2質譜條件

電噴霧離子源離，離子源參數：毛細管電壓3 500 V；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣流量7 L/min；霧化氣壓力45 psi；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流量11 L/min；電離方式：電噴霧離子源，負離子模式；采集方式：多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）。牛磺酸質譜檢測參數設定見表2。

表2牛磺酸質譜檢測參數設定表

TTaabbllee 22 MMaassss ssppeeccttrraall ppaarraammeetteerrss ffoorr ttaauurriinnee ddeetteeccttiioonn

參數　　　定性離子（m/z）定量離子對（m/z）駐留時間/s錐孔電壓/V碰撞池電壓/V牛磺酸　　124.0　79.9　200　120　10 107　10

1.3.3樣品處理

稱取2.00 g（±0.05 g）乳粉樣品于50 mL離心管中，加入35 mL純凈水，渦旋5 min；用移液槍準確加入2.50 mL 1.199 mol/L乙酸鋅和2.50 mL 0.25 mol/L硫酸亞鐵氰化鉀溶液后定容至50 mL，渦旋5 min；于4 ℃，13 000 r/min離心5 min；取上清液1.0 mL過0.22 μm膜于進樣瓶中，備超高效液相色譜串聯質譜檢測。

2　　結果與分析

2.1樣品處理結果

圖 1　牛磺酸標準（10 mg/L）譜圖（A）、乳粉樣品譜圖（BB）Fig.1　Mass spectra of taurine standard （10 mg/L） （A） and milk powder sample （B）

乳粉樣品中含有大量的蛋白質，給牛磺酸的檢測帶來了困難，所以在分析時首先要除去樣品中的蛋白質。現有的除去蛋白質的方法主要有固相萃取法［21-22］和蛋白沉淀法［23-24］。固相萃取法原理是當樣液經過固相色譜柱時，牛磺酸將會被固相萃取柱中的固定相保留，而蛋白質則隨樣液流出，以達到分離的目的。該方法具有樣品凈化效率高的優點，但固相萃取柱成本較高，凈化步驟較為繁瑣。蛋白沉淀法則是通過向提取液中加入沉淀劑使蛋白沉淀來達到凈化目的，該方法操作簡便、快捷，因此本實驗使用蛋白沉淀法進行樣品處理。

本實驗分別選用了乙腈、硫酸鋅、硫酸亞鐵氰化鉀和乙酸鋅的混合溶液做為沉淀劑來去除樣品中的蛋白質。采用乙腈作為蛋白沉淀劑，由于牛磺酸不溶于乙腈，因此部分牛磺酸會隨蛋白一同沉淀，回收率較低，不能滿足檢測要求；采用硫酸鋅去除蛋白效果較好，經硫酸鋅去除蛋白后樣液澄清，且硫酸鋅溶液對牛磺酸的提取效率較高，但使用該方法對于含糖量較高的乳粉進行處理時，回收率較低，只有60%左右，因此乙酸鋅作為沉淀劑不適用于含糖乳粉中牛磺酸的檢測；而采用硫酸亞鐵氰化鉀和乙酸鋅的混合液作為一種蛋白沉淀劑，利用乙酸鋅與亞鐵氰化鉀發生反應生成的氰亞鐵酸鋅沉淀來挾走或吸附干擾物質，可用于乳粉樣品的蛋白沉淀以及可溶性糖類的凈化，因此本實驗選擇硫酸亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作為沉淀劑達到了滿意的樣品處理效果。如圖1所示。

2.2質譜分析中對樣品的基質效應的去除

基質效應主要表現為使用同一條件進行分析時，相同質量濃度的目標物質在純溶劑中和基質中的影響存在較大的差異。如圖2所示，將500 μg/L的溶劑標準溶液和基質標準溶液在同一條件下，經C18柱分析后，溶劑標準溶液峰形呈高斯分布，響應較高，而基質標準溶液峰形很差，不能達到檢測要求。主要是因為經1.3.3節方法處理后的樣品中含有大量的脂肪類物質并未去除，經C18色譜柱進行分析時，牛磺酸保留較弱，與樣液中的脂肪類物質同時被洗脫進入質譜檢測，降低牛磺酸的離子化效率，基質效應比較明顯。

圖2　　經CC1188色譜柱分析后牛磺酸基質標準與溶劑標準的對比譜圖Fig.2　Comparative mass spectra of taurine standard in solvent and matrix after separation on C18column

目前常見的去除基質效應的方法一般有加入同位素標記的內標物、優化樣品前處理方法、優化色譜和質譜條件、進樣前稀釋、基質匹配標準溶液進行校準等。本實驗是通過優化色譜條件（即選擇HILIC色譜柱）來去除乳粉中脂肪類物質對牛磺酸的基質效應的影響。HILIC色譜柱采用中性的酰胺鍵合基團，利用親水作用色譜原理，對強極性、水溶性堿性有機化合物有較好的保留；因此采用HILIC色譜柱對嬰幼兒乳粉中的牛磺酸進行測定時，脂肪類物質不被HILIC色譜柱所保留率先流出，因此與牛磺酸有較好的分離，從而有效地去除了基質效應的影響，能夠達到乳粉中牛磺酸的檢測要求，見圖3。

圖 3　經HILIC色譜柱分析后牛磺酸基質標準譜圖（50000 μgg//LL）Fig.3　Comparative mass spectra of taurine standard in solvent and matrix after separation on HILIC column （500 μgg/L）

2.3質譜分析中影響電離因素的優化

電噴霧離子源電離技術的原理是在毛細管的出口處施加高壓，使從毛細管流出的液體在高電場中霧化成細小的帶電液滴，隨著溶劑的蒸發，液滴表面的電荷強度逐漸增大，最后爆裂為大量的帶一個或多個電荷的離子，使得被分析的目標物以單電荷或多電荷的形式進入質譜中［25］。

影響電噴霧離子源電離的因素有很多，比如流速、電壓等離子源的設置，分析物本身的特性，質子化物質在電噴霧離子源中是低質量范圍物質干擾的來源等等。本實驗主要通過霧化器溫度、干燥氣流速以及流動相的pH值3 個方面對其進行優化，實驗最終確定，最佳的霧化器溫度為300 ℃；最佳的干燥氣流速為7 L/min；流動相的緩沖溶液為50 mmol/L乙酸胺。

2.4方法學考察

2.4.1線性關系

取牛磺酸標準儲備液，按照逐級稀釋的原則配制250、200、150、100、50 μg/L的標準溶液，超高效液相色譜串聯質譜檢測。以峰面積為縱坐標，牛磺酸質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，結果表明在50～250 μg/L質量濃度范圍內呈線性，標準方程為y=661.2x－27 297，線性相關系數R2為0.999 0。

2.4.2回收率、精密度、相對標準偏差（relative standard devition，RSD）、檢出限

為考察樣品前處理對牛磺酸目標物的凈化提取效率，本實驗平行稱取4 個乳粉樣品各2 g，一個做空白，另外3 個添加1 mg/L牛磺酸溶液50、100、200 μL于50 mL的離心管，使用上述方法測得牛磺酸的加標回收率后每一個點平行做8 次，測得精密度，見表3。加標回收率在72%～97%范圍，RSD在2.16%～3.33%范圍內，說明本方法準確度高，精密度高。依據此方法，該儀器測定牛磺酸的儀器檢出限為50 μg/L，該方法檢出限為1 mg/L。

表3　回收率及精密度值Taabbllee 33 　　RReeccoovveerriieess ooff ttaauurriinnee iinn ssppiikkeedd bbllaannkk ssaammppllee%

2.5樣品分析

表 4　超高效液相色譜串聯質譜測定嬰幼兒乳粉中牛磺酸的結果Taabbllee 44 　　TTaauurriinnee ccoonntteenntt ooff iinnffaanntt mmiillkk ppoowwddeerr ddeetteerrmmiinneedd bbyy UPLC-MMSS//MMSSmg/100 g

在市場上隨機抽取嬰幼兒乳粉8 批，按照實驗所給的條件測定乳粉中牛磺酸的含量，測得的結果以及樣品標示牛磺酸含量如表4所示。結果表明市場售賣的嬰幼兒乳粉中牛磺酸的含量與樣品標示基本一致，符合國家標準的限量要求。

3　　討論與結論

在Massimo［18］、Mario［19］等對牛磺酸的研究中，采用超高效液相色譜串聯質譜與超高效薄層色譜質譜方法檢測能量飲料中牛磺酸的含量。Massimo等［18］對能量飲料中牛磺酸的檢測方法簡便；Mario等［19］采用柱后衍生法檢測能量飲料中的牛磺酸，此方法操作較復雜。但能量飲料相對于嬰幼兒乳粉，沒有蛋白質和脂肪等大分子雜質，處理較方便，甚至可以直接測定；而嬰幼兒乳粉中的蛋白質和脂肪影響樣品的處理過程，需要一個適合的方法去除這些雜質，以免影響樣品的檢出和靈敏度。本實驗在他們研究成果的基礎上，很好地去除了乳粉中的蛋白質等雜質，建立了一套去除基質效應、優化影響電離因素，快速、高效的測定嬰幼兒乳粉中牛磺酸的方法。

本實驗利用超高效液相色譜串聯質譜法測定嬰幼兒乳粉中的牛磺酸，樣品前處理用硫酸亞鐵氰化鉀和乙酸鋅去除蛋白，并離心過膜去除雜質；方法對樣品的凈化效果好，操作簡便，快速。采用HILIC色譜柱進行樣品檢測，可以有效地降低基質效應，整個檢測在8.0 min內完成。色譜條件便于掌握，檢出限低；結果準確度高，靈敏度高，對于同時進行大批量樣嬰幼兒乳粉中牛磺酸的檢測有重要意義。

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Direct Determination of Taurine in Infant Milk Powder by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

CHEN Xiaofeng1， ZHOU Wei2，*， XIE Yingshuang2
（1. College of Geography and Environmental Science， Northwest Normal University， Lanzhou730070， China；
2. Central Laboratory of Technical Center of Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Lanzhou730010， China）

Ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） was applied for the direct determination of taurine in infant milk powder. The sample pretreatment procedure was optimized， and the matrix effect and the factors influencing electrospray ionization （ESI） were evaluated to establish a simple， rapid， low-matrixeffect and sensitive method for determining taurine. The results showed that the recovery rate of this method was between 72% and 97%， with relative standard deviation ranging from 2.16% to 3.33%. The instrument detection limit was 50 μg/L，and the method detection limit was 1 mg/L. Quantifi cation using an external standard method could meet the requirements of the European Union and China for taurine detection in infant milk powder. The whole analysis can be accomplished in 8 minutes， and is suitable for the determination of taurine in mass detection of infant milk powder.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）； matrix effects；baby milk powder； taurine

TS252.7

A

1002-6630（2015）24-0280-06

10.7506/spkx1002-6630-201524052

2015-04-01

陳曉峰（1990—），男，碩士研究生，主要從事環境監測研究。E-mail：ghty0794@foxmail.com

周圍（1953—），男，研究員，博士，主要從事食品營養及食品安全分析研究。E-mail：zhouwei845@163.com