‘紅富士’蘋果氣調貯藏期間果皮色澤變化及花青苷合成相關基因相對表達量的差異比較

陳 磊，郭玉蓉*，白 鴿，袁 莉

（陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安　　710119）

‘紅富士’蘋果氣調貯藏期間果皮色澤變化及花青苷合成相關基因相對表達量的差異比較

陳 磊，郭玉蓉*，白 鴿，袁 莉

（陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安710119）

研究采收時蘋果果皮顏色對氣調貯藏期間果皮色澤及花青苷合成相關基因相對表達量的影響，為蘋果貯藏保鮮提供理論依據。以2 種不同色澤的‘紅富士’蘋果為試材，采用色差儀、紫外分光光度計和熒光定量聚合酶鏈式反應法分別測定貯藏期間果皮色值、花青苷、葉綠素含量及花青苷相關合成基因的相對表達量變化。貯藏過程中， 花青苷含量出現波動變化，其中著色好的蘋果果皮中花青苷含量下降幅度為51.36%～69.51%，而著色差的蘋果花青苷含量下降幅度為74.45%～95.30%；著色好的葉綠素含量下降顯著高于著色差的蘋果。采收時著色好的蘋果果皮中花青苷合成相關基因除LDOX外，相對表達量均顯著高于著色差的蘋果；隨著貯藏時間的延長，2 種不同色澤的蘋果果皮中花青苷合成相關基因的相對表達量均顯著降低；但在貯藏后期著色差的蘋果果皮中CHI、F3H、DFR、ANR相對表達量顯著高于著色好的蘋果。隨著貯藏時間的延長，花青苷合成相關基因的相對表達量顯著降低，導致花青苷合成速率下降，花青苷降解，果實發生果皮褪色現象。采收時著色差的‘紅富士’蘋果在氣調貯藏期間比著色好的蘋果更容易發生果皮褪色現象。

蘋果；花青苷；葉綠素；基因表達；采后

蘋果的外觀色澤直接影響其商品價值，尤其在中國這種以鮮食蘋果為主的消費群體中，著色好的蘋果往往更容易被消費者所接受［1-2］。蘋果基因型［3］、采收時果實顏色［4］及貯藏條件［5-7］等因素均會影響果皮色澤。研究［8-10］表明，花青苷積累的多少和分布狀況決定著蘋果果皮紅色著色程度，葉綠素與類胡蘿卜素含量決定著果皮的底色的亮度。貯藏過程中，蘋果果皮花青苷的合成與降解過程是并存的［11］，當蘋果體內花青苷的合成速度小于降解速度時，表現為花青苷降解，進而導致“果皮褪色。采后蘋果花青苷的含量變化除了受外因（如：采收時蘋果果皮色澤、果實損傷情況、1-甲基環丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）、CO2、溫度、乙烯等［4-7，12-13］的影響外，還受到花青苷合成相關基因協調表達的調節作用［9，12，14］。蘋果花青苷的生物合成途徑是［ 15-18］以苯丙氨酸為前體物質，歷經3 個階段：第1階段由苯丙氨酸到4-香豆酰輔酶A，這是許多次生代謝共有的，該步驟受苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）基因活性調控；第2階段由4-香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A到二氫黃酮醇，此步驟是在查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）、查爾酮異構酶（chalcone isomerase，CHI）和黃烷酮3-羥化酶（flavanone-3βhydroxylase，F3H）調控的類黃酮代謝關鍵步驟，并可進一步轉化為花青素和其他類黃酮物質；第3階段是各種花青素的合成，至少有3 個酶：二氫黃酮醇-4-還原酶（dihydroflavonol-4-reductase，DFR）將無色的二氫黃酮醇轉化成無色花青素，再在無色花青素雙加氧酶/花青素合成酶（leucoanthocyanidin dioxygenase，LDOX）的催化下形成花青素；花青素經一系列的糖基化修繕及向液泡的轉運，最終成為顯紅、紫等多種色調的花青苷，或經花青素還原酶（anthocyanidin reductase，ANR）將花青素轉化成表兒茶素。矢車菊素-3-半乳糖苷占蘋果果皮花青苷總量80%以上，因此推測是尿苷二磷酸葡萄糖-類黃酮葡萄糖基轉移酶（UDP-glycose： flavonoid-3-O-glucosyltransferase，UFGT）是形成花青苷的關鍵酶［8，19］。本實驗在前人研究的基礎上，針對蘋果貯藏期間果皮褪色生理現象，結合我國‘紅富士’蘋果貯藏生產實際情況，研究采收時2 種不同色澤的‘紅富士’蘋果在氣調貯藏過程中果皮花青苷合成基因及調節基因的相對表達量，同時測定果皮色澤和花青苷含量變化，以期通過上述研究，為蘋果貯藏保鮮提供理論參考和實驗依據。

1　　材料與方法

1.1材料及貯藏條件

實驗于2013—2014年在陜西華圣果業有限公司貯藏室和陜西師范大學食品學院實驗室進行，材料為陜西洛川一個管理良好的農家果園的不套袋‘紅富士’（Malus×domestica ‘Red Fuji'）蘋果，選擇大小基本一致、果形端正、成熟度一致的無損傷、無病蟲危害的果實，并按照果皮顏色將其分成2 組：著色好（紅色不小于80%）和著色差（紅色不大于20%）。

每組3 筐蘋果（每筐60 個）均放入陜西華圣果業有限公司的氣調庫（（0±0.5） ℃；O2體積分數：2.5%～3.0%；CO2體積分數：1.0%～1.1%；相對濕度：90%～95%；1-MCP：1.01 μL/L密閉處理24 h）進行貯藏，貯藏期間完全按照陜西華圣果業貯藏條件進行管理。兩組蘋果在貯藏中均設置3個重復。貯藏過程中，每組每個重復每2 個月取10 個果實，取出后立即用冰壺帶回實驗室，并測定色差值后，將果實皮（厚度約0.5 mm）、肉分開，并用液氮速凍，然后保存到－80 ℃冰箱貯藏，用以后續實驗。

1.2試劑與儀器

M-MuLV第一鏈cDNA試劑盒上海生物工程公司；Maxima SYBR Green qPCR Master Mix（2X）試劑盒美國Thermo公司；其他試劑為國產分析純。

Multiskan Go全波長酶標儀、NANODROP 2000超微量核酸質量檢測儀、PIKO REAL 96實時熒光定量聚合酶鏈式反 應法（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀美國Thermo公司；CR-400色差儀柯尼卡-美能達投資有限公司。

1.3方法

1.3.1蘋果果皮色澤、葉綠素及花青苷含量的測定

L*、a*、b*、H值測定：采用CR-400色差儀測定2 組蘋果在不同貯藏時期時果皮顏色的L*、a*、b*、H值；蘋果果皮葉綠素含量測定：參照潘增光等［20］的方法。

蘋果果皮花青苷含量測定：參照文獻［21-22］的方法稍加改動。用液氮研磨樣品，按料液比1∶4加入 1% HCl-甲醇溶液，4 ℃冰箱黑暗浸提24 h，將提取液在4 ℃、12 000 r/min離心10 min，上清液用全波長酶標儀測定553 nm 和600 nm波長處吸光度。以每克果皮鮮質量的提取液的吸光度變化值A553 nm-A600 nm= 0.01 作為1 個花青苷單位，以U表示。

1.3.2相關基因的實時熒光定量分析

1.3.2.1蘋果果皮總RNA的提取及cDNA 模板的制備

采用改良的CTAB-LiCl［23］法提取蘋果果皮總RNA，用超微量核酸分析儀對RNA的質量濃度及純度進行檢測，并將質量濃度統一稀釋至100 ng/mL；根據Sangon Biotech公司生產的M-MuLV第一鏈cDNA試劑盒將說明書合成cDNA，－80 ℃保存備用。

1.3.2.2引物設計合成

根據待測基因的序列，用Primer 5.0軟件設計引物，并參考相關文章［4，12］的引物序列，選擇最優引物序列，由上海生物工程公司合成，采用HPLC純化，內參采用Actin （UBQ：U74358）引物序列，見表1。

表1　　‘紅富士’蘋果花青苷合成相關基因相對表達量測定特異性引物TTaabbllee 11 　　　　GGeennee--ssppeecciiffi ic primers used to assess the expression levels of anthocyanin biosynthesis-related genes in ‘Red FFuujjii' apples by qRT-PCR

1.3.2.3qRT-PCR擴增

qRT-PCR反應體系配制按Maxima SYBR Green qPCR Master Mix （2X）說明書進行操作，采用10 μL體系：5.0 μL SYBR premix Ex TaqTM（2*）反應液，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模版1 μL，加ddH2O補至10 μL。混勻，離心，放入PCR儀擴增。反應程序為：1）50.0 ℃預處理2 min；2）95 ℃ 預變性10 min；3）95 ℃ 變性15 s；4）退火60 s（不同基因的退火溫度不同，其中PAL 59 ℃、CHS 54 ℃、CHI 56.5 ℃、DFR 56.5 ℃、ANR 56.5 ℃、F3H 60 ℃、UFGT 61 ℃、LDOX 62.5 ℃和MYB10 59.5 ℃；5）40個循環；6）延伸30 s；7）n-95 ℃ 15 s；8）20 ℃ 10 s。每個樣品重復3次，采用PiKo Real Software 2.0 進行數據記錄及分析。

1.4數據處理

實驗數據采用Excel 進行數據處理和作圖，SPSS 18.0軟件進行顯著性分析。

2　　結果與分析

2.1‘紅富士’蘋果貯藏期間果皮色值的變化

圖 1　　2 種不同色澤‘紅富士’蘋果貯藏期間果皮顏色變化Fig.1　　Color changes of two kinds of colored ‘Red Fuji' apples during storage

由圖1可以知，采收時2 種不同色澤的‘紅富士’蘋果在貯藏期間顏色值隨著貯藏時間的延長均發生變化，L*值均呈先升高后降低的變化趨勢，但著色好的蘋果在貯藏4個月時達到L*值最大值，而著色差的在貯藏2個月時達到L*值最大值；a*值均呈先降低后升高（6個月時達到峰值）再降低的變化趨勢；b *值呈升高趨勢，且著色差的果實波動幅度較小；H值呈先升高后降低再升高的變化趨勢。綜上所述采收時2 種不同顏色的‘紅富士’蘋果隨著貯藏時間的延長，均表現出亮度變暗，紅色減弱，黃色增強的果皮褪色現象。

2.2‘紅富士’蘋果貯藏期間果皮花青苷和葉綠素含量的變化

圖 2　　2 種不同色澤‘紅富士’蘋果貯藏期間果皮花青苷（A）和葉綠素（B）含量的變化Fig.2　　Changes in the contents of anthocyanin （A） and chlorophyll （B）in two kinds of colored ‘Red Fuji' apples during storage

由圖2A可知，2 種不同顏色的‘紅富士’蘋果果皮花青苷含量有顯著差異，著色好的‘紅富士’蘋果采收時果皮花青苷含量為144.56 U/g，而著色差的只有31.10 U/g。著色好的‘紅富士’蘋果貯藏2 個月時花青苷含量降至44.08 U/g，為采收時含量的30.49%，隨著貯藏時間的延長花青苷含量逐漸增加，到貯藏6 個月時含量為74.25 U/g，為采收時含量的51.36%，貯藏8 個月時花青苷含量為64.25 U/g，為采收時含量的44.44%。著色差的‘紅富士’蘋果貯藏2 個月時花青苷含量降至1.46 U/g，為采收時含量的4.69%，隨著貯藏時間的延長花青苷含量也逐漸升高，貯藏6個月時含 量為7.94 U/g，為采收時含量的25.53%，貯藏8 個月時花青苷含量為5.75 U/g，僅為采收時含量的18.49%。上述趨勢與圖1中的a*值變化趨勢吻合，進一步證明花青苷含量是決定蘋果紅色的主要因素之一。

由圖2B可知，2 種不同顏色的‘紅富士’蘋果葉綠素含量在采收存在顯著差異；著色好的‘紅富士’蘋果隨著貯藏時間的延長，果皮葉綠素含量由0.086 mg/g下降至0.01 9 mg/g，呈持續下降趨勢；而著色差的‘紅富士’蘋果葉綠素含量波動不大，其含量由采收時的0.017 mg/g下降至貯藏8 個月時的0.015 mg/g，這也在一定程度上解釋了，與著色好的蘋果相比，著色差的蘋果貯藏期間b*值波動更小。

2.3‘紅富士’蘋果貯藏期間果皮花青苷合成相關基因相對表達量的變化

圖 3　　2 種不同顏色‘紅富士’蘋果貯藏期間PPAALL（AA）　　、CCHHSS（BB）、CCHHII（CC）　　和FF33HH（D）相對表達量Fig.3　　Relative expression levels of （A） PAL， （B） CHS， （C） CHI， and （D）F3H genes in two kinds of colored ‘Red Fuji' apples during storage

由圖3A可知，2 種顏色的‘紅富士’蘋果采收時果皮的PAL相對表達量無顯著差異，貯藏過程中雖然2 種顏色蘋果果皮中PAL相對表達量均呈先下降后升高在下降的趨勢，但二者又有顯著的不同，隨著貯藏時間的延長，著色差的蘋果在貯藏4 個月時PAL相對表達量達到峰值，著色好的蘋果在貯藏6 個月時PAL相對表達量達到峰值，且貯藏6 個月后著色好的PAL相對表達量顯著高于著色差的PAL表達。CHS、CHI和F3H協調作用下將查爾酮轉化成二氫黃酮醇是蘋果花青苷代謝途徑的重要步驟。由圖3B～D可知，采收時CHS、CHI和F3H在著色好的蘋果果皮中的相對表達量均顯著高于著色差的。貯藏過程中，著色差的蘋果果皮CHS相對表達量呈先升高（貯藏2 個月時達到峰值）后降低的趨勢，著色好的蘋果果皮CHS相對表達量呈先降低后升高（貯藏4 個月時達到峰值）再降低的趨勢；2 種不同顏色的蘋果果皮CHI相對表達量均呈先降低后升高（貯藏4 個月時達到峰值）再降低的變化趨勢；著色好的蘋果果皮F3H相對表達量呈先降低后升高（貯藏4 個月時達到峰值）再降低的趨勢，著色差的蘋果果皮F3H相對表達量呈先升高（貯藏6 個月時達到峰值）后降低的趨勢。

圖 4　　2 種不同顏色‘紅富士’蘋果貯藏期間DDFFRR（AA）　　、LLDDOOXX （BB）　　、UUFFGGTT（CC）　　和AANNRR（D）相對表達量Fig.4　　Relative expression levels of （A） DFR， （B） LDOX， （C） UFGT， and （D） ANR genes in two kinds of colored ‘Red Fuji' apples during storage

由圖4可以看出，采收時，著色好的蘋果果皮中除LDOX的相對表達量低于著色差的外，DFR、UFGT和ANR相對表達量均顯著高于著色差的。貯藏過程中，DFR、UFGT和ANR的相對表達量均呈先降低后升高（貯藏4個月時達到峰值）再下降的變化趨勢，且在貯藏4 個月時著色差蘋果果皮DFR相對表達量開始顯著高于著色好的蘋果（圖4A）；貯藏6 個月時，著色差蘋果果皮ANR相對表達量開始顯著高于著色好的蘋果（圖4D），著色好的蘋果UFGT相對表達量均顯著高于著色差的蘋果（圖4C）；著色差的蘋果果皮中的LDOX相對表達量呈下降趨勢，著色好的相對表達量呈先降低后升高（貯藏4 個月時達到峰值）再降低的變化趨勢（圖4B）；貯藏6 個月時ANR在著色差的果實中的相對表達量開始高于著色好的蘋果（圖4D）。

圖 5　　2 種不同顏色‘紅富士’蘋果貯藏期間轉運抑制MMYYBB1100相對表達量Fig.5　　Relative expression levels of MYB transcription factor （MYB10）genes in two kinds of colored ‘Red Fuji' apples during storage

由圖5可以看出，MYB10在2 種顏色的‘紅富士’蘋果果皮中的表達存在顯著差異，著色好的是著色差的2.29 倍。貯藏2 個月時，著色差的果實果皮中MYB10相對表達量高于著色好的；貯藏后期，著色差的相對表達量遠低于著色好的，二者差異2.10～2.80 倍，隨著貯藏時間的延長，果皮中的MYB10相對表達量均呈先升高后降低的趨勢。

3　　討 論

貯藏過程中蘋果的衰老，不僅僅表現在延緩果實硬度下降、pH值升高等內在品質上，還體現在果實的果皮顏色變化上。花青苷和葉綠素是蘋果果皮色素的主要成分［10，24］。研究中發現2 種色澤的‘紅富士’蘋果在氣調貯藏過程中果皮花青苷含量均呈先降低后升高再降低的變化趨勢，葉綠素含量呈顯著下降的變化趨勢，而李秀芳等［11］在研究中發現，‘紅富士’蘋果采后果皮花青苷的含量呈先升高后下降，葉綠素含量呈顯著下降的變化趨勢。此外，本研究還發現著色差的蘋果果皮花青苷含量降解速度大于著色好的蘋果，這與Harb等［3］的研究結果相同。

大量研究表明，蘋果的花青苷合成是在轉錄因子調節下的花青苷合成結構基因協調表達的過程。Ju Zhiguo等［25］發現，紅色蘋果幼期PAL活性很高，但無花青苷合成或者很少合成，隨著果實的發育，PAL活性逐漸降低，但花青苷含量逐漸增加，可見PAL不是花青苷合成的關鍵酶，而本研究也發現，貯藏過程中2 種不同顏色的蘋果PAL相對表達量變化趨勢與色素的變化趨勢無顯著相關性。Ardi等［26］在研究鱷梨中發現乙烯能提高CHS活性，El-Kereamy等［27］進一步發現用乙烯處理成熟的葡萄時可提高CHS的相對表達量，因此著色好蘋果在貯藏4 個月時CHS相對表達量顯著提高。貯藏后期（貯藏4 個月以后）著色差蘋果果皮中的CHI、DFR、ANR和F3H的相對表達量高于著色好的蘋果果皮中的相對表達量，這一結果與Harb等［4］的結果相同。考慮到花青苷作為蘋果果皮多酚中主要的抗氧化劑之一，因此預測造成上述現象的原因是果實為抵御果皮色素降解的生理紊亂現象而需合成更多多酚化合物而產生的一種自身防御機制。考慮到蘋果花青苷的主要成分為矢車菊素-3-半乳糖，因此推測UFGT控制合成的UFGT是形成花青苷的關鍵酶之一，本研究測定2 種不同顏色的‘紅富士’蘋果貯藏期間UFGT的相對表達量變化與花青苷含量變化之間的關系也證實了這一觀點。MYB10作為控制蘋果果皮顏色的主要轉錄因子［14，18］，MYB10在著色好蘋果中的相對表達量顯著高于著色差的蘋果，在本研究中，著色差的蘋果果皮中MYB10的相對表達量與其花青苷含量的變化趨勢一致，但著色好的蘋果貯藏4 個月后花青苷含量開始回升，而MYB10的相對表達量持續下降，因此推測，MYB10不是貯藏期間花青苷合成的關鍵基因。

‘紅富士’蘋果貯藏期間發生的果皮褪色現象，是造成果實商業價值降低的主要原因之一，其機制十分復

雜，不僅與采收時果皮色澤及貯藏過程中花青苷合成相關基因轉錄水平有關，還與果實自身的細胞所在環境及花青苷的合成前提物質及相關降解酶活性等因素有關，因此‘紅富士’蘋果貯藏期間果皮色素降解機制仍需進一步研究，以確定貯藏期間啟動花青苷合成關鍵基因，為蘋果貯藏品質的研究提供理論依據。

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Changes in Pericarp Color and the Expression of Anthocyanin Biosynthesis-Related Genes of Two Kinds of Colored ‘Red Fuji' Apples during Controlled Atmosphere Storage

CHEN Lei， GUO Yurong*， BAI Ge， YUAN Li
（College of Food Engineering and Nutritional Science， Shaanxi Normal University， Xi'an710119， China）

The aim of this study was to explore the effects of harvest color on the pericarp pigment and the expression levels of anthocyanin biosynthesis-related genes of two kinds of colored ‘Red Fuji' apples during controlled atmosphere （CA） storage. The changes in color values， the contents of anthocyanin and chlorophyll in apple peel and the transcriptional profi les of anthocyanin biosynthesis-related genes were measured by colorimeter， UV spectrophotometry， and quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR） during storage， respectively. During storage， the content of anthocyanin changed whereas the content of anthocyanin declined by 51.36%-69.51% in well-colored apple and by 74.45%-95.30% in bad-colored apple. The content of chlorophyll in well-colored ap ple significantly decreased compared to bad-colored apple. At harvest time， the expression levels of anthocyanin biosynthesis-related genes including chalcone isomerase （CHI）， dihydroflavonol-4-reductase （DFR）， anthocyanidin reductase （ANR）， and flavanone 3-hydroxylase （F3H） except leucoanthocyanidin dioxy genase （LDOX） were significantly higher in well-colored apples than in bad-colored apples. During storage， the expression levels of anthocyanin biosynthesis-related genes were si gnifi cantly reduced. After storage for four months， the expression levels of CHI， DFR， ANR， and F3H were signifi cantly higher in bad-colored apples. With the extension of storage time， the expression levels of anthocyanin biosynthesis-related genes were signifi cantly r educed，resulting in decreased rate of anthocyanin synthesis. “Skin burning” more likely happened in bad-colored ‘Red Fuji' apples than in well-colored ones during CA storage.

apple； anthocyanin； chlorophyll； gene expression； postharvest

S661.1

A

1002-6630（2015）24-0326-06

10.7506/spkx1002-6630-201524060

2015-01-15

國家現代農業產業技術體系建設專項（GK661001）

陳磊（1988—），男，碩士，主要從事食品生物技術與食品儲藏研究。E-mail：chen122148@163.com

郭玉蓉（1962—），女，教授，博士，主要從事食品生物加工研究。E-mail：guoyurong730@163.com