百色市某醫院白假絲酵母菌基因分型與耐藥相關性分析

陳文成+農樂根+覃羽華

【摘要】目的分析當地常見的白假絲酵母菌基因型及其耐藥性。方法收集2011年1月～2013年1月右江民族醫學院附屬醫院190株白假絲酵母菌菌株，應用PCR技術對其25SrDNA中的transposable intron基因進行基因型分析。應用MicroScan全自動細菌鑒定儀，對標本分離出的白假絲酵母菌進行鑒定和藥物敏感試驗。結果感染的190株白假絲酵母菌大多數為A型，共112株（58.95%）；A型對5氟胞嘧啶、伊曲康唑和伏立康唑的耐藥率高于B型和C型；A、B、C三型對氟康唑全部耐藥，而對兩性霉素均敏感。結論不同基因型的白假絲酵母菌對藥物的敏感性不同，應針對不同基因型別的白假絲酵母菌應用不同的藥物進行治療。

【關鍵詞】白假絲酵母菌；基因分型；耐藥性

中圖分類號：R34 文獻標識碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.03.003

Analysis of correlation of genotyping and drug resistance

of candida albicans in a hospital in Baise

CHEN Wencheng，NONG Legen，QIN Yuhua▲

（Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China）

【Abstract】ObjectiveTo analyze genotyping and drug resistance of candida albicans which is normally seen in the local region.MethodsA total of 190 strains of candida albicans were collected from Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities from January，2011 to January，2013.Transposable intron gene in 25SrDNA were analyzed by polymerase chain reaction （PCR），identification of candida albicans which was isolated from the specimen and its drug sensitivity test were performed by MicroScan automatic bacterial identification instrument.Results Majority of the 190 infected candida albicans were type A，with a total number of 112 strains（58.95%）.Drug resistance rate of genotype A to 5fluorocytosine，itraconazole and voriconazole was significantly higher than those of genotype B and genotype C.Genotype A，genotype B and genotype C were all resistant to fluconazole，but sensitive to amphotericin.ConclusionDifferent genotypes of candida albicans has different sensitivity to drugs.Thus，different genotypes of candida albicans should be treated by different drugs.

【Key words】candida albicans；genotype；drug resistance

白假絲酵母菌（Candida albicans）是人體內常見的條件致病真菌，近年來，由于濫用廣譜抗生素、大量使用免疫抑制劑以及廣泛運用侵入性技術等原因，導致白假絲酵母菌的感染率顯著增加。白假絲酵母菌感染的特征之一就是存在地區差異，不同地區引起感染的白假絲酵母菌的類型不一樣[1]，因此，研究不同地區白假絲酵母菌的基因型和耐藥性有十分重要的意義。本研究應用PCR技術和常規的藥敏試驗對分離的190株白假絲酵母菌菌株中的25SrDNA進行基因型和耐藥性分析，為臨床診斷和治療提供有利的依據。

1材料與方法1.1菌株 收集2011年1月～2013年1月右江民族醫學院附屬醫院190株白假絲酵母菌菌株，分別來源于男性151例，女性39例，年齡≥45歲。菌株主要來自痰標本（80.64%），其余為咽拭子、尿液、血液、傷口分泌物、大便、穿刺液等標本。所有白假絲酵母菌均經革蘭氏染色鏡檢確認，用MicroScan全自動微生物分析系統進行鑒定。標準菌株：白假絲酵母菌ATCC90028。

1.2培養基血平板、中國蘭培養基、CHROMagar培養基。

1.3PCR試劑Taq PCR MasterMix 購自北京天根生化科技有限公司。PCR儀為美國BioRad基因擴增儀。引物：25SrDNA引物：L（5ATA AGG GAA GTC GGCAAA ATA GAT CCG TAA3）和R（5CCTTGG CTG TGG TTT CGC TAG ATA GTAGAT3），由華大中生科技有限公司合成。endprint

1.4方法

1.4.1細菌培養及鑒定應用MicroScan全自動細菌鑒定儀，選擇細菌鑒定與微量MIC復合板進行微生物鑒定和藥物敏感試驗。結果按NCCLS標準（2010版）判定。采集患者的咽拭子、痰、氣管沖洗物、血液、濃液、糞便等標本，接種于血平板、中國蘭培養基、CHROMagar培養基進行分離培養，用糖發酵（葡萄糖、乳糖、麥芽蓎、甘糖、蔗糖、纖維雙糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、棉子糖、鼠李糖、海藻糖）實驗、革蘭染色及血清學實驗進行菌種鑒定。接種沙保培養基4℃保存，轉種馬鈴薯培養基37℃48～72小時備用。

1.4.2藥敏試驗 白假絲酵母菌藥敏試驗選用臨床常用的抗真菌藥物（5氟胞嘧啶、氟康唑、伏立康唑、兩性霉素、伊曲康唑）進行敏感性試驗。

1.4.3提取白假絲酵母菌DNA用酚氯仿抽提法提取白假絲酵母菌DNA，取2～3種馬鈴薯培養基白假絲酵母菌溶解于200 μL E 液，加入250 μL GPT試劑，離心12 000轉5分鐘，加入等體積的100%異戊醇和1/10醋酸鈉溶液-20℃放置1小時，離心12 000轉20分鐘，用70%冰酒精脫水，無菌TE 液溶解備用。

1.4.4基因分析應用PCR技術對其25SrDNA中的transposable intron基因進行基因型分析，通過其擴增的片段大小，將白假絲酵母菌分成三組：A組（片段大小約450 bp）、B組（840 bp）、C組（450 bp和840 bp）；引物：L（5ATA AGG GAA GTC GGCAAA ATA GAT CCG TAA3）和R （5CCTTGG CTG TGG TTT CGC TAG ATA GTAGAT3）。在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳后，在紫外光透射儀上觀察，攝片并記錄結果。

1.5結果判定根據PCR擴增產物的大小和條帶數目確定基因型，一條450 bp帶為A型，一條840 bp帶為B型，一條450 bp帶和一條840 bp帶為C型。

1.6數據統計記錄白假絲酵母菌的基因分型結果和藥敏試驗結果并分析其相關性。

2結果2.1基因分型結果190株白假絲酵母菌菌株的基因分型根據電泳圖譜分為A、B、C三型（見圖1），其中A型112株（58.95%），B型58株（30.53%），C型20株（10.53%）。

2.2藥敏試驗結果不同基因型白假絲酵母菌的藥敏試驗結果見表1。

圖1 白假絲酵母菌基因分型結果。

表1不同基因型白假絲酵母菌藥敏結果（%）

藥物A型（112株）SIRB型（58株）SIRC型（20株）SIR5氟胞嘧啶84.2105.71000010000氟康唑001000010000100伏立康唑84.2015.292.61.16.193.36.70兩性霉素94.75.201000010000伊曲康唑26.32152.684.25.310.575.66.717.8注：S表示敏感；I表示中介；R表示耐藥。

2.3基因型與藥敏相關性分析本實驗顯示本地感染的白假絲酵母菌大多數為A型，在5氟胞嘧啶、氟康唑、伏立康唑、兩性霉素、伊曲康唑5種常見的抗真菌藥中，A型對5氟胞嘧啶、伊曲康唑和伏立康唑的耐藥率高于B型和C型；A、B、C三型對氟康唑全部耐藥，而對兩性霉素均敏感。

3討論白假絲酵母菌是人體內常見的條件致病真菌，也是最常見的引起深部感染的真菌，越來越受到醫學界的重視[2～4]。全球不同地區、不同人種中，白假絲酵母菌感染的流行病學特征不同；不同地區引起感染的白假絲酵母菌的類型不一樣，由于類型不同，其引起感染的癥狀、對藥物的敏感性及流行病學特征均不同。研究表明，許多院內白假絲酵母菌感染是由內源性感染引起，但真菌外源性感染也是不可忽視的問題[5，6]。因此，研究當地的白假絲酵母菌感染的基因類型和藥物敏感性將有助于了解該地區醫院院內白假絲酵母菌感染的臨床特點、菌種分布特征及誘發該菌感染的危險因素，有助于真菌標本的快速檢驗和鑒定，有助于真菌感染性疾病的早期診斷、早期治療[7～9]。并且可以和其他地區的相關資料進行比對，對預防和治療白假絲酵母菌感染，提高對醫院內感染的認識均有重要意義。本研究應用PCR技術和常規的藥敏試驗對從本院患者分離的白假絲酵母菌菌株中的25SrDNA進行基因型和耐藥性分析。研究結果顯示：190株白假絲酵母菌菌株中，A型占了大多數（58.95%），C型比較少見，未檢出D型和E型。不同基因型白假絲酵母菌的藥敏試驗結果顯示，在5氟胞嘧啶、氟康唑、伏立康唑、兩性霉素、伊曲康唑5種常見的抗真菌藥中，A型對5氟胞嘧啶、伊曲康唑和伏立康唑的耐藥率高于B型和C型；A、B、C三型對氟康唑全部耐藥，而對兩性霉素均敏感。

本實驗所用190株白假絲酵母菌菌株全部分離自我院住院患者，年齡≥45歲，主要以肺部感染疾病為主，并伴有一種或多種基礎疾病，菌株主要來源于痰標本，均有長期大量使用抗生素的病史。研究表明，長期大劑量接受抗生素治療使自身正常菌群受到破壞，機體免疫功能減弱，給真菌的感染創造了良好的條件[10]。了解我院不同基因型別的白假絲酵母菌的分布及耐藥情況，將有助于發現易感菌株，對醫院感染源的追蹤和研究真菌感染情況，指導臨床用藥有重要的意義，對白假絲酵母菌的流行病學的研究有重要價值。參考文獻[1] Myoung Y，Shin JH，Lee JS，et al.Multilocus sequence typing for Candida albicans isolates from candidemic patients：comparison with southern blot hybridization and pulsedfield gel electrophoresis analysis[J].Korean J Lab Med，2011，31（2）：107114.endprint

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（收稿日期：2015-03-31修回日期：2015-06-13）

（編輯：潘明志）endprint