自污染染料中篩選的菌對顏料紫1的脫色

胡翠英，沈玉婷，李良智，錢瑋，郭偉強

（蘇州科技學院化學生物與材料工程學院，江蘇 蘇州215009；江蘇省環境功能材料重點實驗室， 江蘇 蘇州 215009）

隨著染料和印染工業的發展，大量的印染廢水排放到環境中，成為當前主要的水體污染源之一。染料廢水處理的重點和難點都體現在色度的消除（即脫色）。目前對染料脫色的方法較多，如吸 附[1-3]、絮凝[4-5]、化學氧化[6-7]、生物處理等。其中生物處理由于其具有低消耗、環境友好的優勢受到廣泛關注。常見生物處理涉及的菌主要有：真菌，如雙孢菇對偶氮染料的降解[8]、白腐真菌對活性紅等5種染料的脫色[9]；細菌，如Bacillus cohniiMTCC 3616對偶氮染料的降解[10]、蒼白桿菌對孔雀綠的降解[11]、Leucobactersp.對深藍K-R、活性紅等的脫色[12]；混合菌[13]等。從機制上講，上述菌種有的是對染料降解脫色，有的是吸附脫色。當然也有的只提到脫色，但脫色并不總意味著對染料的降解，具體機制還需要進一步分析[14]。總的說來，微生物菌種對于染料的降解或者脫色，在實際工業上的應用還很少。因此，篩選和發現新的微生物菌株來處理染料廢水等對于環境化學工業具有重要的意義。

本工作首先對于實驗室中偶然發現的廣告濃縮玫瑰紅染料（主要顯色原料顏料紫1）中長出的菌進行了篩選，獲得了一株純種菌株。研究采用分子生物學手段，對分離獲得的該菌株進行提取其DNA分析，并利用生物信息學的方法，進行序列相似性比較，構建序列進化樹，確定其與相關物種的親緣關系，進行菌種鑒定。然后，通過在培養基中加入顏料紫1，探討該菌對顏料的脫色情況，深入研究培養條件對脫色率的影響；最后，綜合FTIR分析的結果，對脫色原理進行了初步的分析。

1 材料方法

1.1 材料和培養基

菌種來源：一瓶長滿菌苔的玫瑰紅廣告濃縮染料，其主要顯色原料成分為顏料紫1。顏料紫1結構圖見圖1。顏料紫1由吳江山湖化工有限公司免費提供。

圖1 顏料紫1結構圖

活化培養基：察氏培養基。

利用平板和搖瓶培養分離菌種、斜面保藏菌種。單因素實驗在察氏培養基中根據實驗目的加入不同濃度的顏料紫1、NaNO3，加入相同含量的不同碳源，調節不同pH值條件，30℃培養10天。

在單因素實驗基礎上，利用Design expert軟件設計響應面方案并分析結果，得出較佳培養條件。

1.2 顏料紫1含量測定方法

采用紫外可見分光光度計（北京普析的T6新世紀）對顏料紫1進行吸收峰掃描，得出在557nm波長下，顏料紫有最大吸收峰。制備標準曲線。

發酵液經4℃、14000r/min 離心10min，使得發酵液中的菌體沉淀，將上清液轉移到試管中。將分離到的上清液再經循環水式多用真空泵抽濾，進一步去除上清液中可能殘留的菌體及較大顆粒性物質。加入適量蒸餾水進行稀釋，在557nm 波長下用紫外可見分光光度計測OD 值。以蒸餾水為空白組，分別測定實驗組①、②、③和對照組的OD值A1、A2、A3、A0，代入顏料紫標準曲線方程，求出對應的脫色率X。脫色率計算公式如式（1）。

1.3 發酵前后顏料紫1的FTIR分析

發酵液14000r/min 離心10min；向上清液中加入等體積的乙酸乙酯，用無水NaSO4過夜干燥，過濾；取上清液，用旋轉蒸發儀蒸干，取出干燥物，烘干；向烘干物中以5∶95的比例加入KBr，混勻，壓成片；利用傅里葉變換紅外光譜儀（Spectrum BXII）（FTIR）測定。

2 結 果

2.1 菌種培養與分子鑒定

自顏料中分離得到的菌經培養、平板分離得到單菌落，經鏡檢（圖2）初步判斷為曲霉。利用ITS4、ITS5作為上下游引物，對菌種18S rDNA擴增，得到擴增產物（圖3），條帶大小約為650 bp。經由上海生工測序，結果如下。

圖2 未知菌的孢子圖

圖3 PCR產物電泳分析

TGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCG TAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGAGT GCGGGCTGCCTCCGGGCGCCCAACCTCCCACC CGTGAATACCTAACACTGTTGCTTCGGCGGGG AACCCCCTCGGGGGCGAGCCGCCGGGGACTA CTGAACTTCATGCCTGAGAGTGATGCAGTCTG AGTCTGAATATAAAATCAGTCAAAACTTTCAA CAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAG AACGCAGCGAACTGCGATAAGTAATGTGAATT GCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAAC GCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCA TGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAG CCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCC CGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCA CCGTGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTG TCACCCGCTCGACTAGGGCCGGCCGGGCGCCA GCCGACGTCTCCAACCATTTTTCTTCAGGTTGA CCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTT AAGCATATCAATAAGCGGAGGAA。通過提交到NCBI數據庫中，進行核酸比對，利用MEGA6.06軟件建立進化樹（圖4），發現本研究所篩選出的菌株與雜色曲霉（Aspergillus versicolor）有高度的同源性。

2.2 單因素實驗結果

初步的研究-明：培養基顏色明顯變淺的最短時間為10天，故培養周期均為10天。染料超過一定范圍對菌的生長有抑制作用[15-16]，是影響脫色率的重要因素。本研究中用察氏培養基進行培養時，加入不同濃度的顏料紫1，實驗結果見圖5。濃度在200mg/L處，最大脫色率為52.9%。碳源是影響菌體生長的重要因素之一，本實驗探討了4種碳源（圖6）。結果顯示：碳源為葡萄糖時，染料的脫色效率最高，達到41.59%。乳糖與蔗糖做碳源時脫色率接近，但較葡萄糖為碳源時低。用微晶纖維素做碳源時，脫色率為0，說明此菌不能降解纖維素發酵。

NaNO3屬于中性鹽，可以改變培養基的滲透壓，改變細胞膜滲透性，影響菌體生長。該真菌的生長不需要太高濃度的NaNO3，氮源濃度低至NaNO30.5g/L時，脫色效率反而較高（圖7）。

染料的脫色率與pH值也是密切相關的，pH值較低時（低于5.0），染料的脫色率較差（圖8），而在pH=5.5時，能夠取得較好的實驗結果。pH值不僅對染料被脫色降解的速率有很大的影響，宏觀上還對菌絲球的形態、結構有很大的影響。在pH值低至4.50時，菌絲球結構脆弱、不易成形，往往為松散的糊狀。pH值在5.50～6.00時，形態結構緊致、呈飽滿的圓球狀。而高于6.50時，菌絲球又會發生膨脹、甚至出現松散。

圖4 進化樹

圖5 顏料紫1濃度對脫色率的影響

圖6 碳源對脫色率的影響

圖7 NaNO3濃度對脫色率的影響

圖8 pH值對脫色率的影響

2.3 響應面實驗結果

依據單因素實驗的結果，利用Design-expert設計響應面實驗并分析實驗結果（表1）。表2直觀顯示顏料紫1濃度200mg/L、NaNO3濃度0.5g/L、pH 值5.5的組合最有利于真菌對染料的脫色，平均脫色率可達78.03%。根據Box-Behnken的設計原理，擬合出二次回歸方程為式（2）。

表1 響應面結果分析

表2 響應面設計及實驗結果

式中，A、B、C均是3個因素的編碼值，范圍在-1～1。決定系數為R2=0.9176，回歸模型的P值為0.0048＜0.01，失擬P值=0.3851＞0.1，說明模型回歸極其顯著，失擬不顯著，因此可用于Aspergillus versicolor對顏料紫1脫色的理論預測，無需引入更高次項。其中AC、B2、C2影響顯著，說明顏料紫1和NaNO3之間的相互作用影響脫色率。NaNO3濃度和pH值與脫色率間不是呈直線關系，而呈曲線關系。響應面分析圖見圖9。pH值5.5時，NaNO3濃度在0～0.8g/L范圍內、顏料濃度＞160mg/L時，可以獲得最高的脫色率；NaNO3濃度確定為0.5g/L時，最高脫色率的染料濃度范圍為160mg/L以上，pH值范圍為5.3～5.7；染料濃度確定為200mg/L時，NaNO3濃度在0.1～0.8g/L范圍內、pH值5.3～5.7范圍內效果最佳，取得最大脫色率。綜合分析三因素的最佳范圍為：顏料紫1濃度＞160mg/L，0.8g/L＞NaNO3濃度＞0.1g/L，5.7＞pH值＞5.3。利用Box-Behnken中的Optimization優化得到的較優值為顏料紫1濃度為250mg/L，NaNO3濃度為0.3g/L，pH值 5.5，脫色率可達到84.64%。此方案及預測值與響應面方案中第17個實驗和結果接近。

2.4 FTIR測定結果

圖9 響應面分析圖

圖10 發酵前后顏料紫1的FTIR分析圖

利用FTIR分析發酵前后顏料紫1結構的變化，頻率在400～4000cm-1，研究結果見圖10，除了因為檢測時壓餅的量不同導致發酵后的吸光值較高外，總體而言發酵前后峰形基本沒很大區別。箭頭所示區域約頻率為1700cm-1處是—C=O—基團吸收區，發酵后的吸收值較大，這與發酵后顏料紫1結構中—OH上的—H（見圖8）發生移動有關。頻率在1000～1400cm-1處是=CH—O—CH=的指紋圖區域，發酵前后沒什么變化，說明=CH—O—CH=沒有被破壞。由此可以判斷顏料紫1的結構基本沒有發生大的變化，發酵過程中發生脫色現象的原因應該只是菌體對它的吸附。這也進一步解釋了為何影響脫色的因素與菌體生長量有一定的正相關。

3 分析討論

雜色曲霉（Aspergillus versicolor）又稱為花斑曲霉，目前Aspergillus versicolor因為其產生了相當數量的細胞毒性化合物以及其他的生物活性化合物而受到人們的廣泛關注[17-20]。也有利用雜色曲霉吸附金屬元素，如吸附鉛[21]，吸附Cr(Ⅵ)、Ni(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)等[22]，減少金屬釋放到水中，降低水污染；有的研究了Aspergillus versicolor對有機物的降解，如用Aspergillus versicolor生物降解共聚物丁二酸/己二酸-丁二醇酯（PBSA）薄膜[23]，效果很好；由Aspergillus versicolor解毒和消除雌激素4-壬基酚[24]。Aspergillus versicolor也被用于脫色，如對雷馬素藍活性染料（Remazol Blue Reactive textile dye）[22，25]的吸附脫色，但對脫色的原因沒有具體分析。本研究首次深入分析了Aspergillus versicolor對顏料紫1的脫色，并且利用FTIR比較了發酵前后顏料紫1結構的變化，研究結果表明了該菌對顏料紫1的脫色機制主要是吸附脫色。生物吸附脫色的機理有很多[26]，包括物理化學吸附、離子交換、配位絡合、螯合、靜電作用、微量沉淀等。本研究中通過單因素實驗和響應面法優化分析，得出鹽離子濃度和pH值的變化都會導致脫色率的不同。究其原因，一方面是菌體量發生變化；另一方面菌體表面結構、電荷以及顏料結構都會發生變化，所以離子交換、氫鍵的建立等都會導致吸附量不同，改變脫色率。

4 結 論

對一株從污染的廣告顏料中分離的菌進行了篩選、鏡檢分析和分子鑒定。確定了該菌為雜色曲霉（Aspergillus versicolor）。首次對采用該菌對顏料紫1的脫色進行了較系統的研究，其中脫色的主要機制經過紅外光譜分析確定為吸附脫色。此外，通過研究分析發現適合該菌生長的碳源為葡萄糖，綜合單因素實驗和響應面優化研究得出脫色實驗過程NaNO3濃度在0.3g/L、pH值在5.5、顏料紫1的濃度約為250mg/L為最佳條件。對于吸附脫色的動力學研究與吸附脫色原理還有待進一步分析。

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