葛根芩連湯對(duì)高脂飼料飼喂的大鼠非酒精性脂肪性肝炎的實(shí)驗(yàn)研究

宋紅梅 曲 巖 李紹民▲ 陳景華 張 寧

1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154002；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江佳木斯154007

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一種與代謝相關(guān)的應(yīng)激性肝損傷，主要特征是甘油三酯（TG）蓄積，包括單純性脂肪肝（NAFL）、脂肪性肝炎（NASH）和肝硬化（NAFC）。研究表明，NAFLD已成為無癥狀性轉(zhuǎn)氨酶升高的首要原因[1-3]，同時(shí)又是肥胖、胰島素抵抗、高脂血癥等代謝綜合征相關(guān)組分在肝臟的集中體現(xiàn)，嚴(yán)重威脅著人民的身體健康。從NAFL到NAFC的過程中，NASH起著限速的作用，是形成肝硬化的重要原因之一[4-5]。目前研究證實(shí)，中醫(yī)藥對(duì)NASH的防治具有全方位、多靶點(diǎn)的立體作用，還能針對(duì)發(fā)病的脂代謝紊亂、胰島素抵抗[6-7]、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化損傷等多個(gè)環(huán)節(jié)的效應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行有效調(diào)節(jié)。現(xiàn)代研究表明，葛根芩連湯具有改善血糖，抗炎，抗氧化的作用。所以本實(shí)驗(yàn)選用葛根芩連湯干預(yù)高脂飼料誘導(dǎo)的NASH大鼠模型[8]，為開發(fā)防治NASH有效的中藥制劑提供新思路和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周雄性SD大鼠40只，體重約為（150±200）g，由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)中藥 處方飲片均購(gòu)自北京同仁堂制藥集團(tuán)哈爾濱藥店，依《傷寒論》生藥比例為葛根∶黃連∶黃芩∶炙甘草=8∶3∶3∶2，以該劑量作為低劑量，2倍該劑量為高劑量。用藥劑量按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與60kg成人體表面積比等效量核算比率，計(jì)算動(dòng)物的等效劑量。實(shí)驗(yàn)時(shí)以去純化水配制成所需濃度，放冰箱保存。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)飼料 基礎(chǔ)飼料及高脂飼料（北京科澳協(xié)力飼料有限公司）。

1.1.4 試劑 AST、ALT、TC、TG、HDL-C、LDL-C的全自動(dòng)生化分析試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司）；IL-6、IL-10、TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒（上海信裕生物科技有限公司）。

1.1.5 主要儀器 7160全自動(dòng)生化儀（日本日立公司），美國(guó)MULTISKAN MK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Thermo），CH-6010組織勻漿機(jī)（KINEMATTICA）。其他設(shè)備及器具包括：手術(shù)器械、離心管、移液管、吸管、試管、燒杯等。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立 以高脂飼料連續(xù)飼喂8周[9]，自由飲水、攝食，建立NASH大鼠模型。

1.2.2 分組及處置 全部SD大鼠飼喂基礎(chǔ)飼料1周后，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為空白組、模型組、葛根芩連湯低劑量組、葛根芩連湯高劑量組。空白組給予普通飼料，模型組和給藥組給予高脂飼料。給藥組在飼喂高脂詞料的同時(shí)分別給予10mL/kg鼠重相應(yīng)濃度中藥灌胃；模型組和空白組按鼠重灌服純化水。每天固定時(shí)間進(jìn)行一次灌胃，每個(gè)組的造模和灌胃同行進(jìn)行，實(shí)施8周結(jié)束。

1.2.3 標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)8周結(jié)束全部大鼠取材，取大鼠腹主動(dòng)脈血及肝組織用于血清學(xué)和肝組織相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.4 血清學(xué)指標(biāo) 全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定血清的相關(guān)指標(biāo)：ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C。酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清IL-6、IL-10、TNF-α。

1.2.5 肝組織勻漿上清指標(biāo) 肝臟IL-6、IL-10、TNF-α水平。在冰水浴中，取肝組織利用超聲勻漿機(jī)制成勻漿，靜置一會(huì)，離心后取上清液，按試劑盒說明進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件，計(jì)量資料以（）表示，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝臟酶學(xué)

在血清ALT、AST水平檢測(cè)，模型組顯著高于空白組（P＜0.01），葛根芩連湯高、低劑量組顯著降低于模型組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組血清ALT、AST比較（± s，U/L）

表1 各組血清ALT、AST比較（± s，U/L）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 n ALT AST空白組 10 296.75±3.59 18.59±2.23模型組 10 421.95±12.64** 35.68±3.15**葛根芩連湯低劑量組 10 290.15±15.69## 27.68±4.39##葛根芩連湯高劑量組 10 208.36±16.98## 24.59±4.29#

2.2 血脂

與空白組比較，模型組血清HDL-C水平顯著降低，血清LDL-C、TG、TC含量明顯增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。葛根芩連湯高、低劑量組血清HDL-C水平與模型組相比增加，血清TG、TC、LDL-C水平下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組血清HDL-C、LDL-C、TG、TC比較（± s，mmol/L）

表2 各組血清HDL-C、LDL-C、TG、TC比較（± s，mmol/L）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

?

表3 各組血清IL-6、IL-10、TNF-α 比較（± s）

表3 各組血清IL-6、IL-10、TNF-α 比較（± s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 n IL-6 IL-10 TNF-α空白組 10 24.63±5.16 190.58±15.21 85.39±30.25模型組 10 130.51±12.68** 36.95±10.12** 228.39±20.03**葛根芩連湯低劑量組 10 165.39±10.11## 110.80±10.06## 80.61±10.04##葛根芩連湯高劑量組 10 61.92±15.08## 240.96±30.11# 100.65±20.09##

表4 各組肝組織IL-6、IL-10、TNF-α 比較（± s）

表4 各組肝組織IL-6、IL-10、TNF-α 比較（± s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 n IL-6 IL-10 TNF-α空白組 10 144.63±11.16 253.58±11.21 455.39±10.25模型組 10 180.51±11.68** 216.95±12.12** 608.39±40.03**葛根芩連湯低劑量組 10 65.39±10.51## 250.80±12.06## 530.61±18.04##葛根芩連湯高劑量組 10 68.92±5.08# 246.96±15.11## 530.65±40.09##

2.3 血清IL-6、IL-10、TNF-α測(cè)定

與空白組比較，模型組血清IL-10顯著降低，血清IL-6、TNF-α明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，葛根芩連湯高、低劑量組在增加血清IL-10、降低血清IL-6、TNF-α方面差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

2.4 肝組織勻漿IL-6、IL-10、TNF-α測(cè)定

與空白組相比，模型組肝組織勻漿IL-6、TNF-α水平升高，IL-10水平降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；葛根芩連湯高、低劑量組與模型組相比，對(duì)肝組織勻漿IL-6、IL-10、TNF-α的改善，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

3 討論

雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)NASH的發(fā)病機(jī)制及治療已經(jīng)進(jìn)行了大量研究，但由于該病發(fā)病的復(fù)雜機(jī)制及西藥作用的單一性使研究受到阻礙，而葛根芩連湯治療NASH方面鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠NASH模型[10-11]，該模型的建立符合人類NASH常見的發(fā)病因素，與人類NASH的發(fā)病機(jī)制也基本相似，能出現(xiàn)以胰島素抵抗、代謝綜合征等為特征的全身代謝紊亂表現(xiàn)，肝臟組織病變具有進(jìn)行性發(fā)展的特點(diǎn)。根據(jù)配方的不同，多數(shù)可以在4～8周內(nèi)形成病變程度逐漸加重的NASH模型[12]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，葛根芩連湯可用于治療2型糖尿病濕熱內(nèi)蘊(yùn)證，饋蕩性結(jié)腸炎等疾病[13-15]，具有改善血糖，抗炎，抗氧化的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)遵循中醫(yī)學(xué)“異病同治”的原則[16]選用葛根芩連湯進(jìn)行防治NASH的探索性研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在肝細(xì)胞損害方面，造模8周后，大鼠模型血清ALT、AST水平顯著升高，葛根芩連湯同時(shí)干預(yù)的各組，血清ALT、AST水平較模型組明顯降低，提示葛根芩連湯高、低劑量組同時(shí)干預(yù)對(duì)防治NASH轉(zhuǎn)氨酶升高方面有積極作用；在血脂代謝方面，造模8周后，大鼠模型血清LDL-C、TG、TC含量顯著升高，HDL-C顯著降低，葛根芩湯同時(shí)干預(yù)的各組中，葛根芩連湯高、低劑量組血清HDL-C水平與模型組相比明顯增加，血清TG、TC、LDL-C水平明顯下降，提示葛根芩連湯基本可以達(dá)到對(duì)NASH脂代謝異常的改善作用[17-19]；在血清及肝組織炎性因子方面，造模8周后，大鼠模型血清及肝組織IL-6、TNF-α含量顯著升高，IL-10顯著降低。與模型組相比，葛根芩連湯同時(shí)干預(yù)的各組中，葛根芩連湯高、低劑量組在增加IL-10、降低IL-6、TNF-α方面均差異顯著。提示葛根芩連湯在改善炎性因子方面，不僅對(duì)NASH引起的肝臟局部炎癥有影響，同時(shí)能夠改善全身血清炎癥因子水平，并從抑制促炎因子，提高抑炎因子兩方面動(dòng)態(tài)調(diào)控炎癥的發(fā)展。雖然中醫(yī)藥防治NASH的實(shí)驗(yàn)研究為臨床用藥及新藥開發(fā)提供了更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可以看到中醫(yī)藥多靶點(diǎn)調(diào)控疾病發(fā)生發(fā)展的優(yōu)勢(shì)，特別是在調(diào)節(jié)脂代謝、干細(xì)胞損傷、炎癥等方面效果顯著。然而，其中仍然存在一些問題：目前實(shí)驗(yàn)研究所用的動(dòng)物模型雖然力求在病因、發(fā)病機(jī)制、組織病理學(xué)表現(xiàn)上與人類接近，但仍不能完全符合中醫(yī)傳統(tǒng)的證候?qū)W特點(diǎn)，對(duì)于中醫(yī)藥的實(shí)驗(yàn)研究，仍缺乏病證結(jié)合的理想模型，極大影響了中醫(yī)藥防治NASH的研究進(jìn)展。而且對(duì)于實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果缺少細(xì)致地思考與分析，普遍停留在重復(fù)性認(rèn)識(shí)上，研究結(jié)果回歸臨床的價(jià)值少有體現(xiàn)。所以今后的研究應(yīng)盡可能緊密聯(lián)系臨床實(shí)際，對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行深入地思考分析，必要時(shí)可進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證研究結(jié)果的可靠性，從而為臨床治療提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Farrell GC，Larter CZ.Nonalcoholic fatty liver disease：from steatosis to cirrhosis[J].Hepatology，2006，43（Suppl1）：S99-S112.

[2]de Alwis NM，Day CP.Non-alcoholic fatty liver disease：themist gradually clears[J].J Hepatol，2008，48（Suppl 1）：S104-S112.

[3]Angulo P.GI epidemiology：nonalcoholic fatty liver disease [J].Aliment Pharmacol Ther，2007，25（3）：883-889.

[4]Powell EE，Cooksley WG，Hanson R，et al.The natural history of nonalcoholic steatohepatitis：a follow-up study of forty-two patients for up to 21 years[J].Hepatology，1990，11（1）：74-80.

[5]Caldwell SH Crespo DM.The spectrum expanded：cryptogenic cirrhosis and the natural history of nonalcoholic fatty liver disease[J].Journal of Hepatology，2004，40（4）：578-584.

[6]Nair S，DiehlAM，W isemanM，et a1.Metformin in the treatment of nonalcoholic steatohepatitis：A p ilot open label trial[J].Aliment Pharmacol Ther，2004，20（2）：2.

[7]Uygun A，Kadayifci A，Isik AT，et al.Metformin in the treatment of patients with nonalcoholic steatohepatitis[J].Aliment Pharmacol Ther，2004，19（3）：537.

[8]艾正琳，陳東風(fēng).SREBP-Ic在大鼠非酒精性脂肪性肝病中的表達(dá)及意義[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，28（10）：1063-1065.

[9]王允亮，諸葛麗，李軍祥，等.調(diào)肝化獨(dú)解毒方對(duì)NASH大鼠的治療作用及其機(jī)理研究[J].江蘇中醫(yī)藥，2012，44（5）：71-73.

[10]鐘嵐.非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)消化疾病分冊(cè)，1999，19（3）：175-178.

[11]London RM，George J.Pathogenesis of NASH：animal models[J].Clin Liver Dis，2007，11（4）：55-74.

[12]樓琦，石巧娟，郭紅剛，等.非酒精性脂肪肝大鼠脂質(zhì)代謝及病理變化的動(dòng)態(tài)觀察[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2012，22（3）：5-11.

[13]Tong XL，Zhao LH，Lian FM，et al.Clinical observations on the dose-effect relationship of Gegen Qin Lian Decoction on 54 out-patients with type 2 diabetes[J].Journal of Traditional Chinese Medicine，2011，31（1）：56-59.

[14]趙林華，姬航宇，全小林，等.葛根零連湯治療糖尿病理論探討 [J].中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（2）：280-283.

[15]王浩，徐明，王思程.葛根等連湯對(duì)饋癌性結(jié)腸炎模型大鼠血清Bcl-2、TGF-β1的影響[J].四川中醫(yī)，2011，29（11）：12-14.

[16]李軍祥，陳潤(rùn)花，蘇冬梅，等.中醫(yī)藥治療非酒精性脂肪性肝病研究述評(píng)[J].世界華人消化雜志，2010，18（14）：1443-1451.

[17]Jump BD，Botolin D，Wang Y，et al.Fatty acid regulation of hepatic genetranscription [J].Nutr，2005，135（11）：2503.

[18]Yu P0，Yin D，Kris PM，et al.Long-chain polyunsaturated fatty acids upregulate LDL receptor protein expression in fib- reblasts and HepG2 Cells[J].Nutr，2005，135（11）：2541-2545.

[19]Coleman RA，Lee DP.Enzymes of triacylglycerol synthesis and their regulation[J].Prog Lipid Res，2004，43（2）：134-176.