嗎啡急性處理小鼠的微陣列數據分析和生物標記識別

張文華，王燕平

嗎啡急性處理小鼠的微陣列數據分析和生物標記識別

張文華，王燕平△

目的通過生物信息學方法，識別嗎啡急性處理小鼠的差異表達基因及其富集的通路。方法從高通量基因表達數據庫（Gene Expression Omnibus）下載嗎啡急性處理小鼠的微陣列數據，并調用R語言3.1.0軟件的質量控制包AffyQCReport 1.42.0對數據樣本進行質量控制分析，運用R語言的微陣列數據線性模型識別嗎啡處理前后的差異表達基因，采用表達分析系統檢測算法進行差異表達基因的通路富集分析。結果嗎啡急性處理小鼠的微陣列基因表達數據具有良好的均一性和陣列強度相似性，識別得到Gm11627、Zfand4、Zbtb16、Pkp2和Plin4等481個差異表達基因和癌癥、黑素原生成和絲裂原活化蛋白激酶信號等8條代謝通路。結論所識別的差異表達基因和代謝通路成為嗎啡急性處理小鼠潛在的生物標記。

嗎啡；小鼠；微陣列分析；基因表達；生物學標記；功能富集分析

嗎啡具有鎮痛、止咳、降低血壓等作用［1］。同時，嗎啡的過量吸入會形成神經系統分子和細胞的適應性，進而導致對藥品的耐受、物理依賴和成癮［2］。因此，深入研究嗎啡對人體的生理作用機制，有助于對其高效地利用。生物信息學從核酸和蛋白質序列出發，分析序列中包含的結構功能的生物信息，可部分代替大量的分子生物學工作，具有快捷、高效、覆蓋面廣等優勢［3］。本研究通過微陣列芯片數據的基因表達情況分析嗎啡對小鼠組織進行急性處理前后基因表達的差異，并對差異表達基因進行代謝通路的富集分析，為研究嗎啡對人體的作用機制提供參考。

1　材料與方法

1.1基因表達譜數據本文從高通量基因表達數據庫（Gene Expression Omnibus）［4］下載E-GEOD-7762［2］數據樣本表達微陣列數據，采用Mouse430_2平臺進行檢測，分析流程見圖1。同時從數據庫下載原始raw文件以及該平臺探針注釋信息文件。實驗選用來自美國緬因州巴爾港的Jackson實驗室的4種不同種屬的小鼠（Mice），其種名分別為129P3/J、DBA/2J、C57BL/6J和SWR/J。該微陣列數據實驗組和對照組分別選用12只小鼠為實驗對象，每個種屬各3只，鼠齡8～10周，體質量20～30 g，雌雄不限。嗎啡注射以前，2組小鼠均等量生理鹽水注射4 d，3次/d，食物與水正常喂養。實驗組以20 mg/kg一次性皮下注射嗎啡，4 h以后取小鼠組織樣品進行分析；對照組為等量生理鹽水注射，4 h后取小鼠組織樣品［2］。

Fig.1　The experimental protocol of microarray data on mice who were acutely administered with morphine圖1　嗎啡急性處理小鼠微陣列數據分析流程

1.2微陣列數據均一性分析調用R語言（R programming language）3.1.0軟件的質量控制包AffyQCReport 1.42.0進行微陣列數據的均一性分析。使用該質量控制平臺讀取陣列數據文件，對微陣列數據進行質量評估，得到樣本數據的廂式圖、趨勢圖和質量控制統計圖，以此衡量微陣列數據的均一性［5］。actin3/actin5基因的尺度因子＜3，且actin3/actin5內參基因的尺度因子在-1和1之間，則為芯片數據均一性良好，以線條及端點表示［6-7］。

1.3微陣列數據陣列強度相似性分析調用R語言3.1.0軟件的質量控制包AffyQCReport 1.42.0進行微陣列數據的陣列強度相似性分析，相關系數大于0.90為相似性良好［8］。將微陣列數據輸入質量控制平臺進行質量評估，由R語言輸出該樣本數據的陣列強度相似性報告。

1.4差異表達基因識別首先讀取全部芯片基因數據并進行預處理。輸入原始數據，并對所有樣本表達數據進行背景矯正。刪除沒有對應基因的探針，同時調用R語言3.1.0的geneFilter包，運行其中的featureFilter函數以過濾對應有多個探針的基因，得到部分基因［9］。對上述預處理所得基因進行進一步篩選，運用R語言的微陣列數據線性模型（linear models for microarray data，LIMMA）提取基因表達量差異倍數值大于2的基因［10］。并校正假陽性率（False discovery rate）＜5%和P＜0.05，得到相關的差異表達基因［11］。

1.5通路富集分析本文采用表達分析系統檢測算法（ex?pression analysis systematic explorer，EASE）進行京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集在線分析［12-13］?；贓ASE算法的KEGG通路富集分析通過生物功能信息學微陣列分析注釋（DAVID）網站［14］實現。在KEGG通路分析過程中，提交所得的481個差異表達基因，并設置P＜0.05和通路最小基因數=2作為差異表達基因的富集條件，以篩選差異表達基因富集程度較高的通路。

2　結果

2.1微陣列數據均一性分析2組全部數據的actin3/actin5的尺度因子均＜2，且內參基因actin3/actin5的尺度因子在-1～1之間，芯片數據均一性良好，見圖2。

Fig.2　Intension similarity of microarray data of E-GEOD-7762圖2　E-GEOD-7762微陣列芯片數據陣列強度相似性

2.2微陣列芯片數據陣列強度相似性分析2組的數據相似性均＞0.90，整體陣列強度相似性良好，見圖3。

2.3差異表達基因識別本文共讀取45 101條芯片基因數據，其中10 313條探針基因，最終識別得到481個差異表達基因。差異表達基因的火山圖，見圖4。P值較小的前20個差異表達基因，見表1（僅列出NCBI官方基因簡稱，以P值排序）。微陣列芯片數據與前20個差異表達基因的表達調節熱圖，見圖5。其中P值較小的Zbtb16、Plin4、Pkp2、Cebpa、Gm11627和Zfand4等差異表達基因在實驗組的表達量顯著增大。

2.4通路富集分析嗎啡急性處理小鼠后，差異表達基因主要富集于癌癥、黑素原生成和絲裂原活化蛋白激酶信號等8條通路，以P值排序，見表2。

Fig.4　Volcano plot for P-value versus ratio for each gene samples including subjects and normal samples圖4　2組所有基因數據的P值與表達差異值對應關系火山圖

Tab.1　Top 20 differentially expressed genes identified from the microarray datasets of E-GEOD-7762表1　前20個E-GEOD-7762微陣列數據識別的差異表達基因

3　討論

Korostynski等［2］對小鼠紋狀體轉錄組進行分析，研究嗎啡急性處理后4只不同種屬的小鼠之間轉錄應答的區別，以及嗎啡慢性處理后的基因表達情況。本文對嗎啡急性處理小鼠的微陣列數據進行質量控制分析，識別其差異表達基因，并進行差異表達基因的通路富集分析。質量控制報告顯示芯片數據均一性和陣列強度相似性良好。本文共識別到Gm11627、Zfand4、Zbtb16、Pkp2和Plin4等481個差異表達基因。表達差異最為顯著的前20個基因在嗎啡處理后的表達量變化顯著，差異表達基因富集于癌癥通路、黑素原生成和絲裂原活化蛋白激酶信號通路等8條代謝通路之中，且差異表達基因的富集程度較高，通路最小基因數均≥5，具有統計學意義。

Tab.2　Pathway enrichment analysis based on KEGG表2　基于KEGG的通路富集分析

本文所識別的Gm11627、Zfand4、Zbtb16、Pkp2 和Plin4等差異表達基因在嗎啡對小鼠急性處理前后顯著差異表達，并與該過程導致的生理變化有一定關系。已有研究證明，uGTZB7基因序列的多態性影響嗎啡的體內代謝［15］。大鼠JNK3和GRK基因的表達分別與腦內神經細胞損傷和嗎啡成癮，以及嗎啡急性處理過程中的耐受有關［16］。差異表達基因Zbtb16作為一種轉錄抑制劑，與嗎啡成癮現象和小鼠腦紋狀體的細胞分化功能密切相關［17］。此外，Pkp2基因是導致心律失常性右心室心肌病的重要致病基因［18］。本研究KEGG通路富集分析結果顯示，包括Pkp2在內的6個差異表達基因富集在致心律失常性右心室心肌病代謝通路中，進一步印證了Pkp2在心肌病表達方面的功能，提示嗎啡急性處理后Zbtb16、Pkp2等基因的差異表達可能影響細胞分化，并可能導致嗎啡成癮和心肌病。

已有研究顯示，絲裂原活化蛋白激酶信號廣泛存在于神經元中［19］，通過影響神經突觸的可塑性產生對嗎啡的病理性鎮痛耐受作用［20］。絲裂原活化蛋白激酶信號通路在前額葉皮質磷酸化過程中導致細胞外調節蛋白激酶表達降低，進而參與嗎啡依賴的形成和戒斷反應，造成嗎啡成癮［21］。此外，絲裂原活化蛋白激酶信號通路具有信號轉導作用，因此其在細胞的增殖、分化及凋亡等生化反應過程中起到重要作用。而鞘脂類在脂筏的形成過程中扮演著重要角色，其代謝過程與細胞的信號轉導有關［22］。同時，焦點黏附通常在焦點黏附激酶的作用下發生，該過程可以間接反映細胞與細胞外基質之間的信號傳遞，與細胞遷移、侵襲、存活等生物過程密切相關［23］。代謝通路的富集反映出，嗎啡急性處理后可能發生絲裂原活化蛋白激酶信號轉導、鞘脂的代謝和焦點黏附等生理過程。

綜上所述，嗎啡急性處理后可能發生細胞分化、絲裂原活化蛋白激酶信號轉導、鞘脂的代謝和焦點黏附等生理過程，并可能導致成癮和心肌病。上述差異表達基因及其富集的代謝通路可成為嗎啡對小鼠急性處理潛在的生物標記，為進一步研究嗎啡對人體的作用機制提供了依據。目前生物信息學分析主要集中在多元數據網絡的分析及可視化，蛋白質相互作用的評估和預測，網絡聚類分析和相關子網絡的構建，以及生物功能和代謝通路分析等方面［24］。因此，微陣列數據的擴展、差異表達基因的蛋白質相互作用網絡分析、基因本體分析等，都可能成為今后關于嗎啡對人體作用機制的研究方向。

（圖3、5見插頁）

［1］趙倩華.嗎啡給藥途徑及其新劑型的研究進展［J］.醫藥論壇雜志，2013，34（1）:143-145.

［2］Korostynski M，Piechota M，Kaminska D，et al.Morphine effects on striatal transcriptome in mice［J］.Genome Biol，2007，8（6）:R128.

［3］徐娟.miRNA-miRNA協同調控網絡：構建、疾病miRNA拓撲特征及序列和結構相似性分析［D］.哈爾濱:哈爾濱醫科大學，2011.

［4］Li C，Shen W，Shen S，et al.Gene expression patterns combined with bioinformatics analysis identify genes associated with cholan?giocarcinoma［J］.Comput Biol Chem，2013，47:192-197.

［5］Gautier L，Cope L，Bolstad BM，et al.Affy--analysis of Affymetrix GeneChip data at the probe level［J］.Bioinformatics，2004，20（3）: 307-315.

［6］Wilson CL，Miller CJ.Simpleaffy:a BioConductor package for Af?fymetrix Quality Control and data analysis［J］.Bioinformatics，2005，21（18）:3683-3685.

［7］Raman T，O'Connor TP，Hackett NR，et al.Quality control in micro?array assessment of gene expression in human airway epithelium［J］. BMC Genomics，2009，10（1）:493.

［8］DUNDAS JB.Affymetrix Quality control［EB/OL］.（2011-3-7）［2014-07-26］http://bioinformatics.gr/tutorials/microarray-technol?ogy-basics/maqc/95-affyqc.html.

［9］Kim Y，Doan BQ，Duggal P，et al.Normalization of microarray ex?pression data using within-pedigree pool and its effect on linkage analysis［J］.BMC proceedings BioMed Central Ltd，2007，1（Suppl 1）：S152.

［10］Smyth GK.Linear models and empirical bayes methods for assess?ing differential expression in microarray experiments［J］.Stat Appl Genet Mol Biol，2004，3（1）:3.

［11］Reiner A，Yekutieli D，Benjamini Y.Identifying differentially ex?pressed genes using false discovery rate controlling procedures［J］. Bioinformatics，2003，19（3）:368-375.

［12］Huang DW，Sherman BT，Lempicki RA.Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources ［J］.Nature protocols，2009，4（1）:44-57.

［13］Ford G，Xu Z，Gates A，et al.Expression Analysis Systematic Ex?plorer（EASE）analysis reveals differential gene expression in per?manent and transient focal stroke rat models［J］.Brain Res，2006，1071（1）:226-236.

［14］Huang DW，Sherman BT，Lempicki RA.Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources ［J］.Nat Protoc，2009，4:44-57.

［15］龔妍，曹迪，李智平.UGT2B7代謝酶，阿片μ受體及ABCB1基因多態性對小兒嗎啡鎮痛效能影響的研究進展.第二十三屆全國兒科藥學學術會議論文集［C］.石家莊:中國藥房雜志社，2012.

［16］范學良.嗎啡對GRKZ、GRKS和JNK3基因在大鼠腦內表達調控的研究［D］.上海:復旦大學，2002.

［17］Piechota M，Korostynski M，Solecki W，et al.The dissection of tran?scriptional modules regulated by various drugs of abuse in the mouse striatum［J］.Genome Biol，2010，11（5）:R48.

［18］張明昌，張寧生，童奇，等.PKP2基因突變與青壯年猝死綜合征.全國第九次法醫學術交流會論文集［C］.北京:中國法醫學會，2013.

［19］Shen N，Guo RX，Hu F，et al.Spinal Cx43 mediates chronic mor?phine antinociceptive tolerance through JNK pathway in rats［J］.CHI?NESE PHARMACOLOGICAL BULLETIN，2013，29（03）372-376.

［20］張樂，朱永平.絲裂原活化蛋白激酶信號通路在嗎啡依賴中的作用［J］.中國藥物依賴性雜志，2012，21（2）:100-104.

［21］閻春霞，李陽，張宏星，等.腦前額葉皮層MAPK通路在嗎啡成癮記憶中的作用.全國第九次法醫學術交流會論文集［C］.北京:中國法醫學會，2013.

［22］劉圣紅，茍萍.鞘脂類的研究進展［J］.生物技術，2009，19（2）:96-98.

［23］袁周:焦點粘附激酶在肝癌中表達及其對人肝癌細胞MHCC97-H作用的研究［D］.上海:中山醫院，2006.

［24］陳剛.生物網絡分析及其在復雜疾病研究中的應用［D］.長沙:中南大學，2012.

（2014-07-28收稿2014-08-15修回）

（本文編輯陸榮展）

Microarray datasets and biomarker in mice who were acutely administered with morphine

ZHANG Wenhua1，WANG Yanping2
1 Department of Anesthesiology，Third Hospital Affiliated to Qiqihaer Medical College，Qiqihaer，Heilongjiang 161000，China；2 Evidence-Based Medicine Technology Development Center in Jinan
△Corresponding AuthorE-mail:1102207555@qq.com

ObjectiveTo identify the differentially expressed genes and functional enrichment pathways using bioin?formatics technology in mice who were acutely administered with Morphine.MethodsFirst，we downloaded microarray da?tasets of mice which were acutely administered with Morphine from Gene Expression Omnibus，and assess the quality control parameters of the microarray datasets using AffyQCReport 1.42.0 package by R programming language 3.1.0 software.Subse?quently，the differentially expressed genes of the microarray datasets were identified using the linear models for microarray data of R language.Finally，functional pathways of the differentially expressed genes were enriched based on expression anal?ysis and systematic explorer.ResultsThe microarray datasets showed preferable uniformity and intension similarity.A to?tal of 481 differentially expressed genes including Gm11627，Zfand4，Zbtb16，Pkp2 and Plin4 were identified.While 8 func?tional enrichment pathways，including pathways in cancer，melanogenesis and mitogen-activated protein kinase signaling were revealed.ConclusionThe differentially expressed genes and functional pathways were the underlying biomarkers of mice who were acutely administered with Morphine.

morphine；mice；microarray analysis；gene expression；biological markers；enrichment of functional analysis

R318.04

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.013

2012年國家醫學教育發展中心課題項目（2012-03-07-142）

1黑龍江齊齊哈爾，齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院麻醉科（郵編161000）；2濟南，濟南循證醫藥科技開發中心科研

張文華（1972），女，碩士，副主任醫師，主要從事麻醉技術及麻醉用藥研究

△通迅作者E-mail:1102207555@qq.com