間歇低氧合并肺氣腫大鼠模型肝臟氧化應激及凝血功能的研究

馬懿江，何慶，胡志東△，馮靖

間歇低氧合并肺氣腫大鼠模型肝臟氧化應激及凝血功能的研究

馬懿江1，何慶2△，胡志東1△，馮靖3

目的建立肺氣腫合并間歇低氧（IH）的重疊綜合征（OS）大鼠模型，探討OS大鼠肝臟炎性損傷及其凝血功能的變化。方法將60只雄性Wistar大鼠隨機分成正常組（A組）、IH組（B組）、肺氣腫組（C組）和IH合并肺氣腫組（D組）。通過對大鼠進行16周的熏煙暴露造成大鼠肺氣腫；從13周開始，同時施加程控預制的間歇低氧/再氧合（IH/ROX）處理對大鼠進行IH暴露4周。暴露結束后取各組大鼠肺和肝臟組織于光鏡下觀察并計算肝臟炎性損傷病理評分。取肝組織勻漿采用ELISA方法測定其超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）濃度。檢測血漿纖維蛋白原（FIB），血漿因子FⅧ促凝活性（FⅧ:C）、血管性血友病因子抗原（vWF:Ag）和抗凝血酶活性（AT:A）水平。結果D組肝臟炎性損傷病理評分和凝血因子FIB、FⅧ:C、vWF:Ag水平均高于A、B、C組，而SOD和CAT活性以及AT:A水平低于其他3組（均P＜0.05）。FIB、vWF:Ag、FⅧ:C、AT:A與SOD呈明顯相關（r分別為-0.905、-0.941、-0.946和0.817，均P＜0.01）。結論OS動物模型下IH和肺氣腫在導致氧化應激和高凝狀態上具有一定疊加效應，可引起更強的肝臟炎癥反應和血栓前狀態。

肺氣腫；間歇低氧；氧化應激；超氧化物歧化酶；過氧化氫酶；丙二醛；凝血因子

阻塞性睡眠呼吸暫停（OSA）以上氣道周期性部分或全部關閉為主要特征，通常伴氧飽和度下降和睡眠反復覺醒［1］，發病率為2%～25%，且患病率呈逐年上升趨勢［2］。慢性阻塞性肺疾病（COPD）的病理改變主要表現為慢性支氣管炎和肺氣腫，后者通常引起更嚴重的低氧、肺動脈壓升高以及更高的病死率。COPD和OSA共存稱為重疊綜合征（OS），在成年人群中發病率約為1%［3］。OS患者相對單純OSA 或COPD常伴有更顯著的肺炎性損傷及血管內皮系統激活狀態，導致卒中、急性冠脈綜合征等一系列事件的發生［4］。目前認為COPD和OSA均屬于慢性系統性炎癥的組成部分。間歇低氧（IH）可造成線粒體電子傳遞鏈的功能障礙，導致活性氧（ROS）的釋放，而再氧合（ROX）進一步激化此過程［5］，因此IH/ROX引起的氧化應激成為COPD和OSA聯系的關鍵［6］。研究發現低氧造成的高凝狀態使COPD患者更容易出現靜脈血栓栓塞［7］。因此，本研究通過建立肺氣腫合并睡眠IH動物模型，以探討其肝臟氧化應激及凝血功能變化的特點及其相關機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組健康雄性4周齡Wistar大鼠60只，體質量120～150 g，購自中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物中心。按隨機數字表法將大鼠分為4組，每組15只：正常組（A組），IH組（B組），肺氣腫組（C組），肺氣腫合并IH組（D組）。

1.1.2試劑和儀器大前門香煙（天津卷煙廠）；混合氣體（天津六方氣體公司）；HE染液、ELISA試劑盒（南京建成生物科技公司）。熏煙箱和密封箱為儲物箱和密封盒改制；組織勻漿器、37℃烤箱由天津醫科大學內分泌研究所提供；氧濃度檢測儀（瑞士夏美頓公司）；血氣分析儀（瑞士羅氏AVL 995）；凝血分析儀（美國貝克曼ACL9000）；日本Olympus光學顯微鏡及圖像采集系統；北京航空航天大學彩色病理圖像分析系統。

1.2方法

1.2.1OS大鼠模型的建立通過熏煙暴露造成大鼠肺氣腫，在此基礎上進行IH暴露，方法與本組既往研究一致［8］：A組：正常飼養；B組：從13～16周IH暴露：大鼠每天于睡眠時段（9:00～17:00）置于自制IH艙內，向艙內循環充入N2和空氣，每一循環包括N230 s（使艙內最低氧濃度達到5%）和空氣90 s（使艙內氧濃度恢復至21%）；C組：常氧狀態，持續煙熏暴露16周，于非睡眠階段將大鼠置于自制熏箱內熏吸香煙，2次/d，30 min/次；D組：IH暴露13～16周，持續煙熏暴露16周。

1.2.2腦電圖監測和動脈血氣分析暴露前1周隨機抽取5只大鼠監測各期睡眠腦電波。暴露結束前2 d，取此5只大鼠右股動脈血測量其動脈血pH值、二氧化碳分壓［p（CO2）］、氧分壓［p（O2）］和氧飽和度（SaO2）。

1.2.3血液指標測定暴露結束后收集每組剩余10只大鼠的靜脈血8 mL，檢測白細胞（WBC）計數、淋巴細胞（LYM）分類、紅細胞（RBC）計數、血紅蛋白（HGB）濃度和血小板（PLT）計數。經枸櫞酸鈉抗凝檢測血漿抗凝血酶活性（AT:A）、纖維蛋白原（FIB）、血漿因子FⅧ促凝活性（FⅧ:C）和血管性血友病因子抗原（vWF:Ag）。

1.2.4標本處理取大鼠肺、肝臟組織各1 g，以4%甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察。另取肝組織1 g研磨制成勻漿，采用ELISA方法檢測超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）濃度［9］。

1.2.5肝臟炎性損傷病理評分方法觀察指標：炎細胞浸潤程度和范圍，肝細胞水腫程度和范圍，肝細胞點狀壞死范圍。每項均按正常0分，較輕1分，輕度2分，中度3分，較重4分，重度5分進行評分，滿分5分。每項指標表示為實際得分占最高預計分數的百分比。

1.3統計學方法采用SPSS 18.0軟件處理數據。計量資料以±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間多重比較采用Bonferroni法，相關性分析采用Pearson法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1動脈血氣分析A組結果基本符合正常生理狀態；C組p（O2）輕度降低，符合大鼠肺氣腫特點；B組和D組p（O2）＜60 mmHg，符合大鼠間歇低氧的狀態，見表1。

Tab.1　Blood gas analysis between all four groups表1　動脈血氣分析結果　（n=5，±s）

Tab.1　Blood gas analysis between all four groups表1　動脈血氣分析結果　（n=5，±s）

1 mmHg=0.133 kPa

組別A組B組C組D組p（O2）（mmHg）94.30±2.61 51.52±1.18 73.02±2.18 45.36±2.33 p（CO2）（mmHg）41.86±2.34 37.02±0.91 48.86±2.89 42.34±3.15 SaO20.971±0.003 0.869±0.018 0.918±0.006 0.837±0.028 pH值7.41±0.01 7.42±0.01 7.36±0.01 7.41±0.01

2.2肺組織光鏡特征C、D組大鼠肺氣腫病理特征顯著，表現為肺組織間質增厚和薄壁組織炎癥，其中D組伴有炎細胞大量浸潤，肺泡平均截距增高和平均肺泡數下降，見圖1。

2.3肝臟組織光鏡特征A組動物肝臟病理基本正常，B組有輕微炎癥，而C、D組可見明顯炎細胞浸潤、肝細胞腫脹和氣球樣變，提示其肝臟炎性損傷嚴重，見圖2。

2.4肝臟病理損傷和氧化應激水平肝臟炎性損傷病理評分和MDA濃度為D組＞C組＞B組＞A組（均P＜0.05），SOD和CAT活性為D組＜C組＜B組＜A組（均P＜0.05），見表2。

2.5血常規檢查結果WBC、LYM、RBC、HGB和PLT水平均是D組＞C組＞B組＞A組（均P＜0.05），見表3。

Tab.2　Comparison of hepatic histological scores and indicators of oxidative stress among four groups表2　4組的肝臟炎性損傷病理評分和氧化應激指標比較　（n=10，±s）

Tab.2　Comparison of hepatic histological scores and indicators of oxidative stress among four groups表2　4組的肝臟炎性損傷病理評分和氧化應激指標比較　（n=10，±s）

＊P＜0.05；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，P＜0.05

組別A組B組C組D組F肝臟炎性損傷病理評分（%）8.00±1.49 13.60±2.95a58.00±4.62ab80.00±6.33abc672.494＊SOD （U/mg protein）88.30±4.51 79.17±2.63a73.97±2.24ab63.86±3.73abc90.206＊CAT （U/mg protein）113.82±6.31 92.46±5.31a79.03±5.06ab49.85±3.62abc270.257＊MDA （nmol/mg protein）0.74±0.10 1.71±0.15a3.31±0.36ab6.73±1.47abc118.267＊

Tab.3　Hematologic analysis表3　4組血常規指標比較　（n=10，±s）

Tab.3　Hematologic analysis表3　4組血常規指標比較　（n=10，±s）

＊P＜0.05；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，P＜0.05

組別A組B組C組D組F WBC（×109/L）3.34±0.21 3.52±0.26a4.64±0.55ab6.48±0.61abc106.16＊LYM 0.425±0.029 0.577±0.055a0.649±0.030ab0.837±0.045abc169.03＊組別A組B組C組D組F RBC（×1012/L）7.01±0.09 7.46±0.07a8.04±0.29ab8.60±0.21abc134.38＊HGB（g/L）122.20±6.25 136.30±5.06a145.90±5.80ab157.20±8.07abc53.91＊PLT（×109/L）829.80±23.90 974.40±30.46a1 134.80±73.78ab1 352.60±92.35abc130.02＊

2.6凝血/抗凝因子檢測凝血因子FIB、vWF:Ag 和FⅧ:C為D組＞C組＞B組＞A組，而AT:A則為D組＜C組＜B組＜A組（均P＜0.05），見表4。

Tab.4　Comparision of coagulant/anticoagulant factors between all groups表4　各組大鼠凝血/抗凝因子水平比較　（n=10，±s）

Tab.4　Comparision of coagulant/anticoagulant factors between all groups表4　各組大鼠凝血/抗凝因子水平比較　（n=10，±s）

＊P＜0.05；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，P＜0.05

組別A組B組C組D組F AT:A（%）123.10±3.28 117.10±2.89a105.37±5.78ab96.12±5.35abc71.57＊FIB（mg/L）1 347.3±64.8 1 531.2±68.6a1 757.9±78.1ab2 013.3±66.3abc171.07＊vWF:Ag（%）48.89±2.50 57.52±2.36a65.31±2.37ab72.57±3.83abc129.45＊FⅧ:C（%）116.35±3.83 198.68±7.91a231.03±13.52ab315.92±26.13abc289.05＊

2.7相關性分析SOD與FIB、vWF:Ag和FⅧ:C水平呈負相關，與AT:A呈正相關；CAT與FIB、vWF: Ag和FⅧ:C水平呈負相關，與AT:A呈正相關；MDA 與FIB、vWF:Ag和FⅧ:C水平呈正相關，與AT:A呈負相關，見表5。

Tab.5　Correlations between inflammatory parameters and coagulant/anticoagulant factors表5　肝臟氧化應激指標和凝血因子的相關系數

3　討論

本實驗通過對大鼠進行煙熏和IH暴露，成功建立了肺氣腫合并睡眠IH的動物模型。在IH模型中，低氧與再氧合重復進行，細胞內氧急劇降低，產生大量ROS引起機體氧化應激及炎性損傷，且主要發生在再氧合階段［10］。其中脂質過氧化產物MDA可間接反映細胞氧化應激水平；SOD及時清除超氧陰離子自由基，其活性可間接反映細胞清除氧自由基的能力；CAT催化分解過氧化氫，可保護細胞免受ROS造成的氧化應激損傷。本研究中，D組SOD和CAT活性均為最低，MDA濃度為最高，提示肝臟炎癥可能由氧化應激始動的級聯放大反應而引起。據文獻報道，將高脂飲食小鼠暴露于IH環境中，出現比非暴露小鼠更嚴重的肝臟炎癥，且伴有丙氨酸轉氨酶（ALT）水平升高［11］。Barnes等［12］也證實，肝細胞經過低氧/再氧合的刺激之后，胞內ROS累積明顯增加。因此，可能存在某種共同途徑調節氧化應激和炎癥反應，促使OS的抗氧化應激失衡。

本實驗中C組和D組動物經同等程度的熏煙暴露，而后者炎細胞浸潤和平均肺泡數下降程度均更為嚴重，推斷IH可能加重肺氣腫的程度。同時D組肝臟炎性損傷程度高于B、C組，提示IH和肺氣腫在導致肝臟炎癥上可能產生一定的疊加效應。肝臟反復的低氧/再氧合以及兒茶酚胺介導的系統性代謝異常使肝臟代謝向低氧性線粒體呼吸轉變［13］。并且，肺組織所產生的炎癥介質可能通過循環系統播散到全身各處，并激活肝臟釋放更多炎性因子，對其他靶器官造成損害，最后引起系統性炎癥［14］。

D組的WBC、LYM水平高于其余3組，提示外周血中白細胞尤其是淋巴細胞在系統性炎癥中的重要作用。在炎癥之初，激活的淋巴細胞通過釋放ROS和蛋白酶導致炎性損傷和肺氣腫的進展。D組升高的RBC和HGB水平還提示IH可加重由肺氣腫引起的紅細胞增多癥和血液高黏滯狀態。在低氧環境中，HGB的自身氧化更易進行，結果產生更多超氧自由基。由此可見，OS可能通過炎癥和氧化應激的途徑加強高凝狀態，從而促使毛細血管內血栓的形成。

血液中FⅧ通過共價鍵與vWF形成復合物，當凝血酶被激活后，FⅧ與復合物解離，在作用于因子IXa之后被迅速清除。本實驗中，建立了肺氣腫的組別（C、D組）凝血因子水平顯著升高，而抗凝因子則明顯抑制。所以同單純IH組相比，煙熏暴露導致的肺氣腫（不論是否合并IH）不但可造成炎癥前狀態，還能導致較強程度的血栓前狀態和高凝狀態，使血管事件的風險增高，同既往研究相一致［15］。Bendz等［16］首次提出低氧可能是靜脈血栓風險升高的原因之一，并證明低氧能直接調節微循環的內皮系統、屏障系統和凝血功能。據尸檢研究報道，死于COPD惡化的患者有30%存在肺血栓栓塞［17］。

本研究證實，肝臟氧化應激指標（SOD、CAT、MDA）同凝血因子和抗凝因子具有相關性。既往有報道稱炎癥和凝血過程受某種共同的激活途徑和反饋調節的控制［18］。一方面炎癥可影響血栓的形成過程，另一方面凝血亢進和纖溶抑制可導致更嚴重的炎性反應，如此惡性循環。提示IH和肺氣腫在導致氧化應激損傷和破壞凝血功能兩方面呈現出疊加效應［19-20］。

（圖1、2見插頁）

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（2014-10-01收稿2014-10-31修回）

（本文編輯閆娟）

Hepatic oxidative stress and coagulation status in rat model of pulmonary emphysema combined with intermittent hypoxia

MA Yijiang1，HE Qing2△，HU Zhidong1△，FENG Jing3
1 Department of Laboratory，2 Department of Endocrinology，3 Department of Pneumology，General Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300052，China

ObjectiveTo establish the rat overlap syndrome（OS）model of intermittent hypoxia（IH）combined with pulmonary emphysema and to explore its connection with hepatic oxidative stress，inflammatory status in the live and coagu?lation profile.MethodsMale Wistar rats（n=60）were randomly divided into four groups:control group（A），IH group（B），pulmonary emphysema group（C）and OS group（D）.The rat model of pulmonary emphysema was established by exposing rats in smoke for 16 weeks.From the 13thweek，pre-programmed intermittent hypoxia/re-oxygenation（IH/ROX）exposure was given in the meantime of smoke exposure in OS group.Liver tissues were sectioned or triturated for pathological scoring or for detecting expression levels of superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT）and malondialdehyde（MDA）respectively.Se?rum levels of coagulant/anticoagulant factors such as antithrombin（AT），fibrinogen（FIB），von Willebrand factor（vWF）and FactorⅧ（FⅧ）were also evaluated using biochemistry analysis.ResultsThe levels of pathological scores and coagulant factors（FIB，FⅧ:C and vWF:Ag）were significantly higher in group D than those in group A，B and C.The values of SOD，CAT and AT were significantly lower in group D than those in other three groups.Serum levels of FIB，vWF:Ag，FⅧ:C and AT:A correlated with SOD（r equal to-0.905、-0.941、-0.946 and 0.817 respective，P＜0.01）.ConclusionIn rat overlap syndrome when IH combined with pulmonary emphysema，hepatic inflammation and coagulability present mutual promotion effect and produce a more significant liver-derivative inflammatory and prothrombotic status.

pulmonary emphysema；intermittent hypoxia；oxidative stress；superoxide dismutase；catalase；malondialde?hyde；blood coagulation factors

R563.3

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.002

國家自然科學基金資助（81270144，30800507，81170071）

1天津醫科大學總醫院檢驗科（郵編300052），2內分泌科，3呼吸科

馬懿江（1987），女，碩士在讀，主要從事睡眠低氧性疾病研究

△E-mail:hech69@hotmail.com；huzhidong27@163.com