糖基化改造β-葡萄糖醛酸苷酶的熱穩定性

王小艷，樊艷爽，韓蓓佳，馮旭東，李春,

（1天津大學化工學院，天津 300072；2北京理工大學生命學院，北京100081）

引 言

大量研究表明糖基化是調節酶活性和穩定性的關鍵因素，可以賦予許多蛋白質有益屬性和功 能[1-4]。蛋白質經糖基修飾后能避免熱力學降解，提高其熱穩定性，而天然糖基化蛋白質的糖基側鏈的去除會降低其熱力學穩定性，從而增加蛋白質聚集的可能性[5-6]。例如，糖基化在維持組織蛋白酶E穩定性中發揮重要作用，潛在糖基化位點的去除導致了組織蛋白酶E對熱和酸穩定性的下降[7]。Fonseca- Maldonado等[8]發現，畢赤酵母中重組表達的糖基修飾的木聚糖酶與大腸桿菌中表達的未發生糖基化的對照酶相比熱穩定性得到顯著提高。研究表明，糖基化可提高彈性蛋白酶rPAEd 在有機溶劑中的穩定性，使其在70℃時的半衰期延長至32.2 min, 與未糖基化的對照（23.1 min）相比熱穩定性有了顯著改善[5]。另外，由于糖鏈自身的親水性，經過糖基化修飾后蛋白質的水溶性可能會發生變化，有利于一些糖蛋白的分泌[9]。由于糖基化具有賦予蛋白質有益特性和功能的潛力，近年來糖基化在蛋白質改造方面得到越來越廣泛的關注。

真核生物中N-糖基化識別位點主要有N-X-T和N-X-S兩種形式，研究發現N-X-T結構比N-X-S結構更容易被糖基化[10]。但很多自然界蛋白質存在自身含有的潛在糖基化位點并未被糖基修飾的現象，有研究表明，位于蛋白結構反向轉角區上的糖基化位點天冬酰胺前面2～3個位置的氨基酸為苯丙氨酸時，有利于芳香族側鏈和糖鏈的N-乙酰葡糖胺相互作用，從而提高糖基化效率，該特征氨基酸序列主要有3種形式：F-N-X-T、F-X-N-X-T和F-X-X-N-X-T，具有該特征的序列被稱為EAS（enhanced aromatic sequon）序列[11-12]。而隨著對糖基修飾和糖蛋白之間關系的研究，發現將N-糖鏈引入蛋白質適當的二級結構中能增加其結構穩定性。因此通過定點突變來減少或增加糖基化位點，對探索N-糖基化對全局糖蛋白的影響是一種有效手段。

β-葡萄糖醛酸苷酶（GUS，EC 3.2.1.31）屬于糖苷酶，大部分屬于糖基水解酶第二家族，它能催化各種類型的β-葡萄糖醛酸苷水解產生多種衍生物同時釋放出β-葡萄糖醛酸[13]。相關研究表明，該酶可以轉化甘草酸（GL）生成單葡萄糖醛酸甘草次酸（GAMG）[14-18]，且與GL相比，GAMG具有極性適中、安全性更高及生物利用度更高等優點，更能滿足工業生產應用的需求。前期將來自Penicillium purpurogenumLi-3菌中的β-葡萄糖醛酸苷酶在畢赤酵母中重組表達后發現其發生了糖基修飾，而經糖基修飾后的β-葡萄糖醛酸苷酶（PGUS-P）的熱穩定性與野生型相比得到明顯提高[19]。

考慮到糖基化對糖蛋白熱穩定性的顯著影響，本研究以PGUS-P為研究對象，基于結構模擬對其進行半理性設計，通過定點突變技術在該酶的氨基酸序列中引入具有EAS序列的新N-糖基化位點，并對突變酶進行活性檢測和糖基化驗證，同時對突變酶的催化特性和熱穩定性進行分析，以期得到含有不同位點糖基化的熱穩定性提高的β-葡萄糖醛酸苷酶，同時也為將來對其他工業用酶穩定性的改造提供一種新思路和理論基礎。

1 實驗材料與方法

1.1 菌株與質粒

表達宿主畢赤酵母P.pastorisGS115和大腸桿菌BL21（DE3）Star為本實驗室自行保藏。用于分子克隆實驗的克隆宿主為（E.coli）Top10購自博邁德公司，畢赤酵母和大腸桿菌的表達質粒模板為潛在糖基化位點突變了的pGAPZ-Pgus-ungly和pET28a-Pgus-ungly（圖1），為實驗室自行構建保存。

圖1 質粒示意圖 Fig.1 Schematic diagram of plasmid

1.2 酶和試劑

PCR相關試劑如rTaq DNA聚合酶等購自TaKaRa公司；凝膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自北京博邁德科技發展有限公司；限制性內切酶，如BlnI、DpnI等購自TaKaRa公司。

1.3 微生物的培養

大腸桿菌的培養：采用 LB培養基，37℃，搖床轉速170 r·min-1時培養12 h。

畢赤酵母P.pastorisGS115的培養：采用YPD培養基，30℃，搖床轉速170 r·min-1，培養3 d。

1.4 定點突變

①以質粒為模板，利用表1中的引物克隆整個質粒，同時在目標基因上引入突變位點；②PCR產物可直接利用DpnI消化甲基化或半甲基化的模板；③將酶切產物直接轉化到大腸桿菌Top10感受態細胞中；④篩選到陽性克隆、測序正確后將質粒在表達宿主中表達。

表1 引物序列表 Table 1 Primers sequence table

1.5 突變酶的表達

大腸桿菌的表達體系構建與突變酶的表達參照Merck Novagen 的pET表達系統說明書。

畢赤酵母P.pastorisGS115的表達體系構建與突變酶的表達根據Invitrogen公司pGAPZ表達載體操作手冊進行操作。

1.6 重組蛋白的純化及SDS-PAGE分析

大腸桿菌表達蛋白的純化采用Ni Fast Flow鎳柱親和色譜柱進行；畢赤酵母表達蛋白的純化采用Q Sepharose Fast Flow強陰離子交換柱進行；蛋白質的丙酮沉淀，向培養基中加入等體積的預冷的丙酮，輕輕混勻后，4℃，12000 r·min-1離心10 min，收集蛋白沉淀，最后加入適量的緩沖液溶解蛋白。SDS-PAGE分析，樣品處理：取樣品40 μl加入10 μl蛋白上樣緩沖液重懸，在沸水浴中煮沸5 min后離心后取上清電泳；制膠，參考說明書配制10%的分離膠和5%的濃縮膠；電泳：初始電壓控制在80 V，等樣品泳過濃縮膠后將電壓調節到120 V直至電泳結束；染色和脫色：將凝膠剝下后用考馬斯亮藍R250染色液染色1 h，然后用脫色液脫色，期間換脫色液1～2次，脫色充分后拍照保存。

1.7 糖蛋白PAS染色

PAS（ periodic acid-Schiff’s base method）染色方法：利用品紅的高碘酸-希夫試劑，通過對糖鏈染色來檢測糖蛋白的存在。取出SDS-PAGE后的凝膠，將其在10%冰醋酸-35%甲醇溶液中浸泡1～2 h以固定蛋白條帶；然后將固定后的凝膠取出用5%的冰醋酸清洗2次，每次10 min；然后把凝膠浸泡在用5%冰醋酸配制的1%的高碘酸溶液中，在4℃中黑暗條件下氧化1 h；用5%冰醋酸將凝膠漂洗幾次后，用50 ml的偏重亞硫酸鈉溶液（0.2 g偏重亞硫酸鈉溶于100 ml 5 %冰醋酸）浸泡10 min；用Schiff試劑于4℃避光染色1 h；染色完畢后將凝膠用大量5%冰醋酸進行清洗，即可見紅色糖蛋白電泳條帶。

1.8 糖蛋白糖苷酶F酶法

糖苷酶F酶切條件如下：①20 μg糖蛋白在1×糖蛋白變性緩沖液中，100℃煮沸10 min，使糖蛋白變性。②加入1/10體積的10×G7緩沖液及10% NP-40。③加入1～5 μl PNase F，37℃溫育1 h，將酶切后樣品進行SDS-PAGE檢測。

1.9 β-葡萄糖醛酸苷酶的活性測定

以硝基苯-葡萄糖醛酸苷（p-NPG）為底物的 酶活測定：取10 μl酶液加40 μl p-NPG（1.25 mmol·L-1）最適溫度下反應10 min后，加入200 μl、0.4 mol·L-1的碳酸鈉終止反應，用酶標儀（405 nm）檢測樣品溶液中對硝基苯酚的含量。β-葡萄糖醛酸苷酶活力定義：一個活力單位（U）為上述條件下，每分鐘催化生成1 μmol對硝基苯酚所需的酶量。

以甘草為底物的酶活測定：取100 μl 酶液與400 μl甘草酸緩沖溶液反應，一定溫度下反應一段時間后，沸水浴處理10 min使酶失活，樣品與甲醇的混合比例為1:9，用HPLC檢測GL、GAMG 和GA 的含量。采用高效液相色譜外標法對甘草酸、GAMG 和甘草次酸進行測定，儀器設置參數為：島津LC-10A，色譜柱：Shim-pack，VP-ODS，檢測器：SPD，檢測波長：254nm，流動相：甲醇:0.6%乙酸=81:19，進樣量：10 μl，流速：1 ml·min-1，柱溫箱：40℃，工作站：LCsolution。β-葡萄糖醛酸苷酶活力定義為：在一定條件下，每分鐘消耗1 nmol 的甘草酸所需要的酶量為一個活力單位。

1.10 突變酶催化特性的測定

溫度穩定性：將β-葡萄糖醛酸苷酶液放于65℃水浴中保溫，分別在不同時間間隔取樣，測定剩余酶活力，以初始酶活作為參照，確定β-葡萄糖醛酸苷酶的溫度穩定性。

動力學常數的測定：在最適pH條件下配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 g·L-1的甘草酸溶液，取一定量的酶液與甘草酸溶液在40℃反應，10 min后，進行酶活檢測。采用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法計算酶動力學參數。

1.11 結構模擬分析

蛋白質結構模擬采用SWISS-MODEL進行同源建模，模板選取已經公布的大腸桿菌來源的β-葡萄糖醛酸苷酶蛋白三維晶體結構（PDB編號：3K46）[20]，結構顯示分析均采用PyMol軟件完成。

2 結果與討論

2.1 N-糖基化位點的設計

根據PGUS-P氨基酸序列（Genebank 登錄號為EU095019），對其一級結構進行分析選取目標N-糖基化位點。首先，為提高新糖基化位點發生糖基修飾的可能性，選擇最易將其突變成為具有EAS（enhanced aromatic sequence）序列特征的糖基化位點，其次兼顧改變較少氨基酸即可形成EAS序列的原則，初期選取了10個目標N-糖基化位點。

為進一步分析新設計的糖基化位點是否合理，以已經公布的大腸桿菌來源的β-葡萄糖醛酸苷酶蛋白三維晶體結構為模板（PDB編號：3K46）[20]，利用SWISS-MODEL對PGUS-P的結構進行同源建模，并結合PyMOL蛋白質三維結構分析軟件對PGUS-P三維結構進行展示與分析。從蛋白質二級結構上來說，糖基化在loop/turn區發生概率較高[21]，進一步從初期選取的10個目標N-糖基化位點中選取位于loop/turn區的突變位點；而從蛋白質三級結構上分析，避免選取位于蛋白質亞基結合面，且靠近活性中心的序列，最終確定了3個位于蛋白質三維結構表面且遠離活性中心同時位于loop/turn區的目標序列突變為EAS序列，其突變序列見表2，這3個新的糖基化位點在PGUS-P蛋白結構上的位置分布情況如圖2所示。

表2 目標突變序列 Table 2 Targeted sequon

從圖2中可見，1號目標突變EAS序列位于氨基酸序列的26～30之間，該段氨基酸序列位于PGUS-P三維結構中的糖基結合保守域，將其命名為PGUS-P-26；同樣位于該區域的還有2號目標突變EAS序列（氨基酸序列35～39），將其命名為PGUS-P-35；而3號（命名為PGUS-P-259）則位于免疫球蛋白β-三明治狀結構域。

圖2 突變位點在β-葡萄糖醛酸苷酶三維結構上的位置分布 Fig.2 Location of EAS on subunit form of PGUS-P (a) [E414 and E505 (labeled in red) were two presumed activity catalytic residues] and location of EAS on tetramer form of PGUS-P (b)

圖3 PGUS-P-26，PGUS-P-35和PGUS-P-259與PGUS-P蛋白結構比對 Fig.3 Structural alignment of mutant enzymes and PGUS-P (Red and yellow represent sequence before and after mutation, respectively)

為考察3個目標突變位點氨基酸的突變是否引起PGUS-P結構的改變，利用SWISS-MODEL將突變后的序列重新建模，將PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259建模后的結構與PGUS-P進行疊合比對，分析新糖基化位點對β-葡萄糖醛酸苷酶本身結構的影響。疊合比對結果如圖3所示，由圖3可以看出，與PGUS-P結構相比，只有PGUS-P-26的氨基酸改變導致了蛋白局部結構的變化，但并未引起蛋白三級結構的變化，而PGUS-P-35和PGUS-P-259的蛋白質結構在氨基酸改變前后并未發生變化。進一步說明新設計的3個糖基化位點進行N-糖基修飾是合理可行的。

2.2 突變酶的表達及糖基化驗證

選擇了適度甘露糖糖鏈的畢赤酵母對目標突變序列進行糖基修飾的底盤宿主，同時選擇了組成型分泌表達載體pGAPZa通過定點突變成功構建了3個突變酶的畢赤酵母表達體系。經培養表達后利用丙酮沉淀法對培養液上清中的蛋白進行初步濃縮，用SDS-PAGE進行檢測目標蛋白是否表達，從圖4的結果可以看出，3個突變酶均獲得了成功表 達，突變酶蛋白條帶大小均與原始PGUS-P的蛋白分子量大小相同。

圖4 突變酶SDS-PAGE檢測分析 Fig.4 SDS-PAGE of crude enzyme from Picha pastoris

為驗證3個含有新N-糖基化位點的突變酶是否都成功引入糖基修飾，首先選擇糖蛋白分析中較為常用的PAS染色。將SDS-PAGE后的凝膠進行PAS染色，從3個突變酶的PAS染色結果[圖5（a）]中可以看出，PGUS-P及3個突變酶均能觀察到紫紅色條帶，而大腸桿菌中表達β-葡萄糖醛酸苷酶PGUS-E泳道則沒有紫紅色條帶出現。為了進一步觀察目標條帶的變化，將PAS染色后的凝膠重新進行考馬斯亮藍染色，結果如圖5（b）所示，經藍染后，目標位置出現明顯條帶，而原本無條帶的PGUS-E也出現藍色條帶。以上結果可以初步確定3個突變體均成功引入糖基化修飾。

為了更進一步確認突變酶發生了糖基修飾，采用了糖苷酶F作為去糖鏈劑來處理目標酶樣品。酶切前后樣品分別進行SDS-PAGE，檢測糖苷酶處理前后分子量變化，SDS-PAGE結果見圖6。從結果中可以看出，3個突變酶糖苷酶F酶切前后條帶均發生遷移，表明酶切后由于糖鏈的去除，分子量發 生了變化。酶切前大小與自身含有糖基化的PGUS-P一致，而酶切后大小則與無糖基化的PGUS-E大小保持一致，糖苷酶F酶切結果表明3個突變酶均發生了糖基修飾。

圖5 突變酶的PAS染色 Fig.5 SDS-PAGE of mutants stained by PAS

圖6 糖苷酶F處理前后SDS-PAGE電泳圖 Fig.6 SDS-PAGE analysis of mutant enzymes treated with/without PNGase F

2.3 突變酶的催化特性分析

為檢測獲得的突變酶是否具有活性，對純化得到的突變酶樣品進行了以p-NPG為底物的酶活檢查，如圖7所示，發現不同糖基化位點比酶活呈現較大差異。PGUS-P -35的比酶活為141.5 U·mg-1，明顯高于對照PGUS-P的106.1 U·mg-1，PGUS-P-259與PGUS-P相比也有所提高，為125.5 U·mg-1，而PGUS-P-26的比酶活卻下降為60.07 U·mg-1。此種現象可能與發生糖基化的位點不同有關系，PGUS-P-26的突變位點的糖基修飾可能影響到了酶的正常活性導致其比酶活下降。Miller等曾報道過當把endothelial lipase（EL）的N373、N449和N471位的糖鏈去除后，EL的酶活降低了70%，但去除N62位的糖鏈，EL的酶活反而提高了5倍[22-23]，也說明了不同糖基化位點對酶活的影響不同。

圖7 畢赤酵母表達突變酶的比酶活測定 Fig.7 Specific activity analysis of mutant enzymes expressed in P.pastoris

利用HPLC分析考察了突變酶水解甘草酸模式（催化特異性）有無發生變化，圖8顯示了各突變酶水解甘草酸反應的結果。甘草酸（GL）為底物，產物為單葡萄糖醛酸基甘草次酸（GAMG）和甘草次酸（GA），三者的保留時間分別為5.2 min，11.6 min和21.3 min[24]。從圖8的結果可以看出，PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259對甘草酸的水解模式均未發生變化，與對照PGUS-P一樣生成GAMG和GA兩種產物。表明不同位點糖基化修飾不會改變β-葡萄糖醛酸苷酶的催化反應類型。該結論與江南大學余曉斌課題組報道的N-糖基化對彈性蛋白酶的底物特異性沒有顯著影響是一致的[5]。

圖8 突變酶水解甘草酸(GL)的模式 Fig.8 Hydrolysis of glycyrrhizin by mutant enzymes

表3 突變酶與甘草酸反應的動力學常數 Table 3 Kinetic parameters of mutant enzymes in GL hydrolysis

大多數情況下，發生了N-糖基化的蛋白質的催化特性要優于與其對應的沒有被糖基修飾的蛋白，盡管有時候糖基修飾并未引起蛋白結構的顯著改變[25]。糖鏈的添加可能通過影響酶蛋白環狀結構域與催化殘基的相互作用來影響酶與底物之間的親和力[26]。為了考察新引入糖基修飾的突變酶在實際催化反應體系中的催化性質，采用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法計算酶反應動力學常數（Km，Vmax，Kcat，Kcat/Km），結果如表3所示。PGUS-P-35的最大反應速率Vmax與PGUS-P相比得到提高，為120.48 μmol·(L·min)-1。三者的Km和Kcat與PGUS-P相比均減小，說明新引入的糖基化不同程度地提高了β-葡萄糖醛酸苷酶與甘草酸底物的親和力，可能是糖基修飾使得酶蛋白空間構象更有利于底物的結合，而且3株突變酶PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259的Kcat/Km與PGUS-P相比分別提高了30.1%，23.9%和12.6%，表明其催化底物甘草酸的效率同時也得到提高。

2.4 突變酶熱穩定性分析

大量研究表明，N-糖基化可以提高蛋白的穩定性，其原因主要有兩個：一是糖鏈的形成可以降低未折疊蛋白的無序度，即提高了一些未折疊的糖蛋白的穩定性；二是由于糖鏈本身是一些分子量較大的親水基團，會增加蛋白的可溶性并且有利于抑制蛋白聚集體的形成[27]。另外，也有研究表明，雖然有時候一些糖蛋白的糖基化并沒有顯著改變蛋白的二級結構，但會減緩其熱失活過程，一定程度上抑制了熱變性過程中蛋白的聚集[28]，這也進一步證明了糖基化可提高蛋白穩定性。為驗證不同位點新引入的N-糖基化對β-葡萄糖醛酸苷酶熱穩定性的影響，首先在大腸桿菌中表達了相應的含有這3個突變序列的 β-葡萄糖醛酸苷酶，分別命名為PGUS-E-26、PGUS-E-35和PGUS-E-259，然后同時考察了有糖基修飾的PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259和無糖基修飾的 PGUS-E-26、PGUS-E-35和PGUS-E-259在65℃時的熱穩定性。將酶液置于65℃水浴中，每隔30 min時間間隔取樣，測定酶活，以保溫前的酶活為對照并記為100%，測定結果如圖9所示。

在65℃保溫時，糖基化突變酶PGUS-P-35和PGUS-P-259的熱穩定性與對照PGUS-P相比得到提高。65℃保溫90 min時，二者剩余酶活力分別維持在95%和93%，而PGUS-P剩余酶活為84%左右。但PGUS-P-26在65℃ 保溫90 min時的剩余酶活僅為74%左右。繼續延長保溫時間可以發現，PGUS-P-35，PGUS-P-259兩突變體的剩余酶活下降非常緩慢，3 h后仍然保留高達85%以上的剩余酶活，而PGUS-P只保留70%以上的酶活。且糖基化系統中表達的 PGUS-P-26，PGUS-P-35和PGUS-P-259熱穩定性均顯著高于非糖基化系統中的表達的相應酶，上述結果表明糖基修飾提高了該酶的熱穩定性。

此外，從圖9（a）可以看出，PGUS-E-26與其對照PGUS-E相比提高約10%，表明該位點的氨基酸突變有利于熱穩定性的提高，但糖基修飾的PGUS-P-26的熱穩定性卻低于對照PGUS-P，原因可能是該位點的糖基修飾影響了酶的局部結構導致其穩定性降低。而PGUS-E-35和PGUS-E-259的熱穩定性與PGUS-E相比并未有顯著變化趨勢[圖9（b），（c）]，說明相應位點的氨基酸突變對穩定性影響不大，但糖基修飾的PGUS-P-35和PGUS-P-259熱穩定性與對照PGUS-P相比明顯提高，進一步說明二者的熱穩定性提高確實是由引入的糖基化引起的。上述結果表明糖基化對β-葡萄糖醛酸苷酶的熱穩定性有顯著影響，且不同位點的糖基化對該酶的影響有明顯差異，這與文獻中報道的不同位點上的糖基化對酶具有明顯不同影響的結論是一致的[8]。

3 結 論

本研究以糖基修飾作為一種新的酶穩定性改造手段，以畢赤酵母重組表達PGUS-P為研究對象，在對PGUS-P結構模擬的基礎上，采用半理性設計方法對其進行糖基改性，利用定點突變方法在β-葡萄糖醛酸苷酶氨基酸序列中引入3個具有EAS序列的新N-糖基化位點，經活性檢測和PAS染色及糖苷酶F酶切分析，獲得了糖基修飾的突變酶PGUS-P-26、PGUS-P-35、PGUS-P-259。研究發現引入糖基化后得到了穩定性優良的兩株突變酶PGUS-P-35和PGUS-P-259，65℃ 保溫90 min時，二者剩余酶活力分別維持在95%和93%；而PGUS-P-26的熱穩定性無明顯變化，推測可能與之前模擬的該位點氨基酸的改變引起其結構的細微改變有關。此外，引入糖基化后，PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259對底物甘草酸的親和力均增加，催化效率分別提高了30.1%，23.9%和12.6%。本研究初步探究糖基化的位點對蛋白質結構以及催化特性的影響，推測位于turn/loop區的糖鏈的添加可能會在一定程度上影響到一些loop環的柔性，從而改變蛋白質結構的剛性。

圖9 突變酶熱穩定性分析 Fig.9 Thermostability analysis of mutant enzymes

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