微生物復(fù)合菌劑法污泥原位減量群落動態(tài)研究

趙鑫，劉一威，李曉東，包震宇，胡筱敏，全燮

(1.東北大學(xué)資源與土木工程學(xué)院，遼寧沈陽110004;2.遼寧省環(huán)境科學(xué)研究院，遼寧 沈陽110161;3.大連理工大學(xué)工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程教育部重點(diǎn)實驗室，遼寧大連116024)

活性污泥法是現(xiàn)有應(yīng)用最為廣泛的污水生物處理技術(shù)，具有技術(shù)成熟、工藝靈活多樣和污水處理效果好等諸多優(yōu)點(diǎn)。但是，產(chǎn)生的剩余污泥中不單含有大量的有機(jī)物質(zhì)，還存在重金屬和致病性細(xì)菌等環(huán)境危險物，容易引發(fā)環(huán)境的二次污染［1］。隨著城市的發(fā)展和人口的不斷膨脹，工業(yè)廢水與生活污水的排放量日益增多，剩余污泥的大量產(chǎn)生成為污水處理廠正常運(yùn)行的巨大負(fù)擔(dān)。2006年，歐洲4萬多家污水處理廠每年產(chǎn)生大約7億噸的干污泥［2］，處理成本350～750歐元/噸干污泥［3］。2000－2010年的10年間，我國城市污水排放量和污泥產(chǎn)生量大幅增長，增長近12倍［4-6］。剩余污泥的大量產(chǎn)生導(dǎo)致后續(xù)處理難度加大，能耗和費(fèi)用也大幅攀升。而且，傳統(tǒng)的以堆肥處理、水體消納、焚燒處理和土地填埋利用為主的剩余污泥處理方法已經(jīng)無法滿足現(xiàn)有需求［7］，現(xiàn)階段，亟待尋求在污水處理過程中實現(xiàn)污泥減量的行之有效的新技術(shù)。

生物法的污泥原位減量，在歐美和日本等國開展研究較多，主要集中在解偶聯(lián)技術(shù)、微生物隱性生長技術(shù)和生物捕食技術(shù)3個方面［8］。微生物復(fù)合菌劑法污泥原位減量技術(shù)是一種較新的污泥減量方法，是將具有自我消化量大和產(chǎn)酶能力強(qiáng)等特性的復(fù)合多功能微生物菌劑投加入活性污泥中，在原系統(tǒng)中減少污泥排放量的一種技術(shù)［8］。這種技術(shù)實現(xiàn)污泥減量的方式主要包括:1)優(yōu)化微生物群落結(jié)構(gòu);2)強(qiáng)化微生物分解代謝;3)延長污泥齡、增加活性微生物數(shù)量;4)生物捕食等4種［9-13］。針對這種污泥原位減量技術(shù)，國內(nèi)外開展了一些研究。李俊［9］和王敏［10］等分別對 MCMP微生物制劑的污泥減量效果和作用方式進(jìn)行了探討，最高實現(xiàn)污泥減量近90%。香杰新［14］等探討了微生物復(fù)合菌劑在膜生物反應(yīng)器中的應(yīng)用，使污泥濃度(MLSS)降低 44.4%。蔡勛江［15］等，分析了微生物菌劑EM1用于SBR處理校園生物污水的能力，MLSS降低6%，并且保證了污水處理效果不受影響。

雖然，目前國內(nèi)外學(xué)者針對微生物復(fù)合菌劑法污泥原位減量開展了一些研究，也獲得了一些很好的實驗結(jié)果。但是，這些研究主要集中在檢測減量效果，缺少在微生物層面的分析。因此，本研究在前人的研究基礎(chǔ)上，嘗試在探討微生物復(fù)合菌劑法污泥原位減量效果和減量穩(wěn)定性的同時，使用分子生態(tài)學(xué)PCRDGGE技術(shù)，對污泥原位減量過程中的微生物群落結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行檢測，嘗試在微生物和分子層面對實現(xiàn)污泥減量的機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)置

實驗裝置如圖1所示，采用5 L的塑料量水杯作為SBR實驗裝置，在底部設(shè)曝氣盤曝氣，由電磁空氣壓縮泵提供曝氣，由氣體流量計控制進(jìn)氣量;由時控開關(guān)控制蘭格蠕動泵的進(jìn)水和排水的時間。

圖1 反應(yīng)裝置示意圖Fig.1 A schematic diagram of the reactor

反應(yīng)裝置設(shè)計有效容積4 L，日處理污水8 L，DO為4 mg/L，控制污泥濃度2 000～2500 mg/L，2組實驗裝置同時運(yùn)行;實驗運(yùn)行第3天，按照日處理水量的2%，向反應(yīng)器中投加微生物復(fù)合菌劑。對進(jìn)出水COD、水溫、總氮、總磷和污泥濃度進(jìn)行監(jiān)測，同時計算污泥的累計產(chǎn)生量和單位產(chǎn)生量的變化。

由于量水杯無法設(shè)置沉淀池排水，因此設(shè)計反應(yīng)裝置由3組時控開關(guān)控制進(jìn)行周期運(yùn)行(圖2所示):進(jìn)水8 min，曝氣2.5 h，沉淀靜置 15 min，排水 5 min;每個循環(huán)運(yùn)行3 h，每個循環(huán)進(jìn)水1 L，每天配水1次，定期排泥。

圖2 時控開關(guān)工作方案Fig.2 The time control switch working program

1.2 污泥減量菌劑

實驗過程中，在投加前對微生物復(fù)合菌劑進(jìn)行2 h的曝氣，按照日處理水量體積的2%，加入反應(yīng)系統(tǒng)中。

1.3 實驗水質(zhì)

為了探討污泥原位減量效果，保證系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定性，進(jìn)水水質(zhì)參考生活污水，采用人工模擬生活污水(COD 320 mg/L)，配水水質(zhì)指標(biāo)參數(shù)如表1所示。

表1 進(jìn)水成分組成Table 1 The inflow water composition mg/L

1.4 微生物群落監(jiān)測

1.4.1 基因組DNA提取和樣品擴(kuò)增

不同時間的活性污泥樣品的基因組DNA使用美國MOBIO公司的Power Soil DNA Isolation Kit試劑盒提取。細(xì)菌基因組DNA使用16S rRNA通用引物擴(kuò)增，引物為Bac 968 F(5’－AAC GCG AAG AAC CTT AC－3’)和 Univ1401 R(5’－GCG TGT GTA CAA GAC CC－3’)，反向引物加 GC clamp(CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G)。PCR使用大連寶生物公司的PCR擴(kuò)增試劑盒，擴(kuò)增程序為:94°C 預(yù)變性5 min;94°C 變性30，55°C 退火30 s，72°C延伸30 s，共30個循環(huán);72°C最終延伸10 min。PCR產(chǎn)物使用10 g/L濃度的瓊脂糖膠電泳檢測。

1.4.2 DGGE 電泳檢測

DGGE電泳檢測使用美國Bio-Rad的DCodeTM突變檢測系統(tǒng)。制備8%的丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度依次為30%和60%，其中變性劑和聚丙烯酰胺的濃度從膠的上方向下方遞增;60°C 下，200 V 電泳4 h［16］。電泳結(jié)束后，凝膠使用 AgNO3染色［17］。

對DGGE凝膠中出現(xiàn)的特異性條帶進(jìn)行切膠回收，經(jīng)第2輪PCR擴(kuò)增和純化后，鏈接至pMD19-T載體(大連寶生物公司)，交由華大基因公司完成測序工作。測序結(jié)果提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，經(jīng)比對后，使用生物信息學(xué)軟件MEGA 4.1的Neighbor-joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹［18］。

2 結(jié)果與討論

2.1 微生物菌劑對污染物去除的影響

空白對照組(NC)和實驗組(TG)2個反應(yīng)器中污染物去除率如圖3所示。

圖3 污染物去除率變化Fig.3 The changes of pollutant removal rates

實驗初期，反應(yīng)器處于啟動階段，污染物的去除還略有波動。投加微生物復(fù)合菌劑之后，總氮、氨氮和總磷去除率略有下降，隨后逐步恢復(fù)到與空白對照組相同。在實驗運(yùn)行過程中，第12天和第21天出現(xiàn)停電，導(dǎo)致第13天和第22天的出水氨氮和總磷略有波動，但是對照組和實驗組的整體趨勢沒有受到影響，差異很小。在反應(yīng)器啟動階段，氨氮去除率在85%～95%之間，隨著系統(tǒng)的逐步穩(wěn)定，氨氮去除率保持在90%以上;由于實驗在6～7月間完成，期間溫度變化較大，可能是總氮和總磷去除效率產(chǎn)生大幅波動的另一個主要原因，在反應(yīng)器運(yùn)行過程中，總氮平均去除率在60%左右，總磷平均去除率在80%以上，其中，在第13～20天和第31～33天，總磷的去除效率接近100%，而且實驗組對總磷的去除效率要優(yōu)于空白對照組。在反應(yīng)器運(yùn)行的33 d內(nèi)，COD的去除率未受到投加微生物菌劑的影響，一直保持在95%左右。

2.2 微生物菌劑污泥原位減量效果

圖4所示為污泥累計產(chǎn)生量和單位污泥產(chǎn)生率變化情況。在實驗初始，空白對照組和實驗組的污泥濃度分別為1 989 mg/L和2 190 mg/L，按照反應(yīng)器容積4 L計算，總污泥量分別為7 956 mg和8 760 mg，實驗組的污泥總量略高于空白對照組。在第3天投加微生物復(fù)合菌劑后，額外增加的微生物使實驗組的污泥累計產(chǎn)量有一個明顯提升。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，實驗組的污泥累計產(chǎn)量的增幅低于空白對照組，隨著實驗的進(jìn)行，空白對照組的污泥量逐步趨近于實驗組，在第24天超過實驗組。實驗終止時，投加微生物復(fù)合菌劑的實驗組較空白對照組累計少產(chǎn)生污泥20.8%。

圖4 污泥產(chǎn)生量和單位產(chǎn)率變化Fig.4 The changes of sludge accumulated production and production rates

2.3 微生物群落多樣性分析

在實驗過程中，使用PCR-DGGE技術(shù)分析了投加微生物復(fù)合菌劑對系統(tǒng)中微生物的群落結(jié)構(gòu)的影響，電泳結(jié)果如圖5所示，其中NC為空白對照組，TG為實驗組。通過比較發(fā)現(xiàn)，2個反應(yīng)器中的微生物群落結(jié)構(gòu)存在很大差異，將電泳中的特異性條帶切膠回收并測序，測序結(jié)果如表2所示，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹見圖6。

圖5 不同時期樣品的16S rRNA基因DGGE電泳譜圖Fig.5 DGGE profile of the 16S rRNA gene during different periods

投加微生物復(fù)合菌劑后，2個反應(yīng)器的微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的差異。在第7～13天，系統(tǒng)內(nèi)的微生物之間產(chǎn)生明顯的競爭，群落結(jié)構(gòu)形成演替變化。NC組條帶少而且清晰，而實驗組的條帶亮度較弱較平均，說明實驗組的微生物競爭較激烈，種群演替速率較快。第16～31天，TG組經(jīng)過前期較為激烈的種群競爭，系統(tǒng)形成穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)，活性污泥中band 8、9、10對應(yīng)的微生物形成穩(wěn)定的優(yōu)勢菌群，同時形成band 2、4、5、6共存的群落結(jié)構(gòu)，而且在15 d的運(yùn)行時間內(nèi)，保持穩(wěn)定。NC組的微生物群落結(jié)構(gòu)仍然處于演替過程中，沒有形成特別穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)，主要以band 6、7、9、12對應(yīng)的微生物為主，其余微生物互相競爭演替。在微生物互相競爭的過程中，一些微生物逐步被淘汰。band 12在NC組中一直存在于反應(yīng)的始終;而在TG組，從第13天開始逐漸減弱，最后消失。band 14在NC組中較弱，但是一直都可以被檢測到，但是在TG組競爭被逐步淘汰。

表2 污泥中微生物16S rRNA比對結(jié)果Table 2 Phlogenic affiliations of 16S rRNA from sludge samples

通過測序結(jié)果比對發(fā)現(xiàn)，在第16～31天的穩(wěn)定期間，實驗組形成的穩(wěn)定微生物群落結(jié)構(gòu)組成主要包括:Exiguobacterium sibiricum(band 2)、Williamsia sp.(band 4)、Rhodobacter sphaeroides(band 5)、Uncultured gamma proteobacterium(band 6)、Actinocorallia sp.(band 8)、Blastomonas sp.(band 9)和 uncultured bacterium clone(band 10)。

向活性污泥中投加微生物復(fù)合菌劑，可以促進(jìn)活性污泥中的微生物的競爭，菌劑中的微生物強(qiáng)化了活性污泥中可以起到減量效果的微生物的數(shù)量優(yōu)勢，加速一些老化和衰弱菌群被淘汰，優(yōu)化活性污泥中的微生物群落結(jié)構(gòu)，在最短時間內(nèi)形成穩(wěn)定的優(yōu)勢菌群。在實驗的第12天和第21天，實驗室出現(xiàn)了幾小時的短暫停電，2組反應(yīng)器的污染物的去除率受到影響;其中總氮的去除率降低至50%左右，停電對NC組的總氮去除效率的影響更為明顯，2次停電導(dǎo)致次日檢測時總氮去除率低于50%。從DGGE譜圖可以發(fā)現(xiàn)，停電導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)改變，與前后2次取樣時間點(diǎn)相比較，NC組的微生物群落結(jié)構(gòu)受影響更為明顯，TG組的微生物群落變化不大，可以推斷是導(dǎo)致NC組總氮去除率明顯降低的原因。投加微生物復(fù)合菌劑，可以強(qiáng)化菌群結(jié)構(gòu)，降低外界因子對微生物群落結(jié)構(gòu)的擾動，保證系統(tǒng)的穩(wěn)定運(yùn)行。

復(fù)合菌劑中存在的一些真菌和放線菌，例如:Actinocorallia sp.(band 8)可以促進(jìn)系統(tǒng)中的活性污泥保持良好的絮凝性和穩(wěn)定狀態(tài)。投加微生物復(fù)合菌劑還鞏固了一些功能菌群的優(yōu)勢地位，通過比較之前的研究發(fā)現(xiàn)，在實驗中檢測到的微生物均為污水處理過程中常見微生物，其中，Rhodobacter sp.(band 5)具有非常良好的聚磷能力［19-20］，Exiguobacterium sp.(band 2)同時具備氨化和固磷能力［21-22］，Williamsia sp.(band 4)具有很好的有機(jī)污染物降解能力［23］，Blastomonas sp.(band 9)與污水中碳循環(huán)有關(guān)［24］。具有污染物降解能力的功能微生物在系統(tǒng)中迅速達(dá)到優(yōu)勢地位，并保持穩(wěn)定，可以提高系統(tǒng)保持污染物的去除能力;穩(wěn)定的功能微生物群落結(jié)構(gòu)降低了受外界影響時對污染物去除率產(chǎn)生波動。

圖6 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹譜圖Fig.6 Phylogenetic tree of dominant populations based on 16S rRNA

3 結(jié)論

1)在SBR系統(tǒng)中投加微生物復(fù)合菌劑可以減少剩余污泥的產(chǎn)生量。在33 d的運(yùn)行時間內(nèi)，與空白對照組相比，實現(xiàn)污泥原位減量20.8%;COD和氨氮的去除效率未受到影響，均保持在90%以上，而T－N和T－P的去除效率較空白對照組略有提高。

2)向活性污泥中投加微生物復(fù)合菌劑，可以促進(jìn)活性污泥中的微生物的競爭，縮短污泥中微生物形成穩(wěn)定群落結(jié)構(gòu)的時間，并增強(qiáng)群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，降低了受外界環(huán)境因子變化影響。

3)微生物復(fù)合菌劑可以強(qiáng)化脫氮固磷和污染物去除能力強(qiáng)的微生物的優(yōu)勢地位，提高污染物去除效率。在本實驗中組成穩(wěn)定群落結(jié)構(gòu)的功能微生物主要為Rhodobacter sp.、Exiguobacterium sp.、Williamsia sp.、Blastomonas sp.、Actinocorallia sp.和一些未被培養(yǎng)的微生物。

［1］AFSHIN T，NASER M，ALI AKBAR A，et al.Investigation of the excess sludge reduction in SBR by oxidizing some sludge by ozone［J］.Iranian Journal of Chemistry and Chemical Engineering，2009，28(4):95-104.

［2］ROMAN H J，BURGESS J E，PLETSCHKE B I.Enzyme treatment to decrease solids and improve digestion of primary sewage sludge［J］.African Journal of Biotechnology，2006，5(10):963-967.

［3］GINESTET P.Comparative Evaluation of sludge reduction routes［M］.［S.l.］:IWA Publishing，2007:15.

［4］梁鵬，黃霞，錢易，等.污泥減量化技術(shù)的研究進(jìn)展［J］.環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備，2003(1):44-52.LIANG Peng，HUANG Xia，QIAN Yi，et al.Research progress on sludge reduction technologies［J］.Tech Equip Environ Pollut Control，2003(1):44-52.

［5］王守仁，王增長，宋秀蘭，等.污泥處理技術(shù)發(fā)展［J］.水資源保護(hù)，2010，26(1):80-83.WANG Shouren，WANG Zengzhang，SONG Xiulan，et al.Development of technique for sewage sludge treatment［J］.Water Resource Prot，2010，26(1):80-83.

［6］陳菊香.剩余污泥減量化-資源化的研究［J］.環(huán)境科技，2011，24(2):7-9.CHEN Juxiang.Research on reduction and reuse of excess sludge［J］.Environmental Science and Technology，2011，24(2):7-9.

［7］賈麗.A+OSA污泥減量工藝物質(zhì)能量轉(zhuǎn)化及其微生態(tài)特性研究［D］.重慶:重慶大學(xué)，2012:11-16.JIA Li.Study on conversion of the mass and energy and microecological characters in A+OSA excess sludge reduction process［D］.Chongqing:Chongqing University，2012:11-16.

［8］張海珍.MCMP-II多功能復(fù)合微生物制劑用于城市污水處理廠污泥減量［D］.重慶:重慶大學(xué)，2008:5-20.ZHANG Haizhen.Full scale study on activated sludge reduction of WWTP using multifunctional compound micrio-organisms preparation［D］.Chongqing:Chongqing University，2008:5-20.

［9］李俊，朱臻，朱國政，等.利用MCMP微生物制劑減少剩余污泥產(chǎn)量的研究［J］.環(huán)境工程學(xué)報，2007，1(12):92-95.LI Jun，ZHU Zhen，ZHU Gguozheng，et al.Study on reducing of excess sludge production by MCMP inoculation［J］.Chinese Journal of Environmental Engineering，2007，1(12):92-95.

［10］王敏，王里奧，包亮，等.多功能微生物制劑用于污泥減量的研究［J］.中國給水排水，2007，23(7):16-19.WANG Min，WANG Li'ao，BAO Liang，et al.Study on application ofmultifunctionalcompound microorganism product forsludgereduction［J］. ChinaWaterand Wastewater，2007，23(7):16-19.

［11］李俊，龐子山，朱臻，等.利用微生物制劑進(jìn)行污泥減量的生產(chǎn)性試驗研究［J］.中國給水排水，2008，24(3):1-4.LI Jun，PANG Zishan，ZHU Zhen，et al.Study on productive experiment of sludge reduction by microbial preparation［J］.China Water and Wastewater，2008，24(3):1-4.

［12］GUJER W，HENZE M，MINO T，et al.Activated sludge model No.3［J］.Water Sci Technol，1999，39(1):183-193.

［13］CABRERO A.Effects of copper and zinc on the activated sludge bacteria growth kinetics［J］.Water Res，1998，32:1355-1362.

［14］香杰新，蔡勛江，范洪波，等.復(fù)合菌劑用于膜生物反應(yīng)器的污泥減量試驗研究［J］.水處理技術(shù)，2009，35(5):98-101.XIANG Jiexin，CAI Xunjiang，F(xiàn)AN Hongbo，et al.Study on addition of hybrid bacteria into membrane bioreactor for sludge reduction［J］.Technol Water Treat，2009，35(5):98-101.

［15］蔡勛江，李嫻，黎曉微.不同微生物菌劑用于SBR處理校園生活污水的研究［J］.工業(yè)用水與廢，2012，43(1):64-67.CAI Xunjiang，LI Xian，LI Xiaowei.Treatment of schoolyard domestic sewage by SBR added with different microbial agents［J］.Ind Water Wastewater，2012，43(1):64-67.

［16］REN N，XING D，RITTMANN B E，et al.Microbial community structure of ethanol type fermentation in bio-hydrogen production［J］.Environ Microbiol，2007，9(5):1112-1125.

［17］BASSAM B J，CAETANO-ANOLLES G，GRESSHOFF P M.Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels［J］.Anal Biochem，1991，196:80-83.

［18］ZHAO X，XING D，ZHANG L，et al.Characterization and over expression of a［FeFe］-hydrogenase gene of a novel hydrogen-producing bacterium Ethanoligenens harbinense［J］.Int J Hydrogen Energy，2010，35:9598-9602.

［19］李廣科，桑楠.球形紅桿菌廢水除磷作用的研究［J］.城市環(huán)境與城市生態(tài)，2001，14:22-24.LI Guangke，SANG Nan.Study on biological phosphate removal by Rhodobacter sphacroides［J］.Urban Env Urban Ecol，2001，14:22-24.

［20］李廣科，趙由才，桑楠.球形紅桿菌磷耐受能力和除磷特性的研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)，2002，21:403-405，416.LI Guangke，ZHAO Youcai，SANG Nan.Tolerance and removal Characteristics of Rhodobacter sphacroides towards phosphate［J］. AgricultureEnvironmentalProtection，2002，21:403-405，416.

［21］閆韞.布吉河生物修復(fù)過程中氮循環(huán)功能菌群分布研究［D］.哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2008:47-55.YAN Yun.Study on the distribution of nitrogen cycling microbial community in bioremediation process of Buji River［D］.Harbin:Harbin Institute of Technology，2008:47-55.

［22］許彥娟，張利平.反硝化聚磷菌的分離篩選及鑒定［J］.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，30:60-63.XU Yanjuan，ZHANG Liping.Isolation screening and identification of denitrifying polyphosphate-accumulating organisms［J］.Journal of Agricultural University of Hebei，2008，30:60-63.

［23］管蕪萌.長慶油田石油污染土壤的原位修復(fù)微生物的篩選和鑒定［D］.西安:西北農(nóng)林科技大學(xué)，2010:7-19.GUAN Wumeng.Filtration and identification of in-situ remedtion microbial ecological for oil contaminated soil in Changqing Oil Field［D］.Xi'an:Northwest A ＆ F University，2010:7-19.

［24］吳文祥.煙草自毒物質(zhì)及其對根際土壤微生物影響的研究［D］.福州:福建農(nóng)林大學(xué)，2010:29-33.WU Wenxiang.Study on the autotoxic substances of tobacco and the effects of autotoxic substances on the rhizospheric microbiology［D］.Fuzhou:Agriculture and Forestry U-niversity，2010:29-33.