鼻咽癌腫瘤干細胞高表達SOD2可對抗順鉑的殺傷作用

林碧華，陳婧，郭春連，余海波，張鑫，周克元，△

鼻咽癌腫瘤干細胞高表達SOD2可對抗順鉑的殺傷作用

林碧華1，陳婧2，郭春連3，余海波4，張鑫5，周克元1，5△

目的 探討鼻咽癌（NPC）腫瘤干細胞對抗順鉑誘導氧化應激損傷的機制。方法 利用CCK-8法測定順鉑對NPC細胞CNE-2與NPC腫瘤干細胞CNE-2S的半數抑制濃度。觀察不同濃度（0.1、0.5、1.0 μmol·L-1）順鉑作用后，細胞內活性氧（ROS）、總谷胱甘肽（GSH）的含量及總超氧化物歧化酶（SOD）的活性改變。實時定量RT-PCR測定1 μmol·L-1順鉑作用于2組細胞48 h后，谷胱甘肽合成酶（GSS）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞基（GCLC）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶調節亞基（GCLM）、SOD1和SOD2 mRNA的表達情況，免疫印跡法檢測SOD2蛋白的表達情況。利用小干擾RNA技術沉默SOD2，并與1 μmol·L-1順鉑共處理2組細胞，用臺盼藍染色觀察細胞的存活情況。結果 順鉑對CNE-2S的半數抑制濃度顯著高于CNE-2（μmol·L-1：9.8±1.1 vs 2.4±0.6，P＜0.05）。在不同濃度的順鉑處理后，2組細胞內ROS水平升高，但CNE-2S在處理前后的ROS水平均低于CNE-2（P＜0.05）。1 μmol·L-1順鉑刺激后，CNE-2S與CNE-2細胞中GSH含量均上升，但2組細胞間無明顯差異（P＞0.05）；2組細胞中SOD活性均上升，且CNE-2S顯著高于CNE-2（P＜0.05）。順鉑處理前后，2組細胞的GSS、GCLC、GCLM和SOD1的mRNA水平無明顯差異，但CNE-2S中SOD2的mRNA及蛋白表達水平高于CNE-2（P＜0.05）。沉默SOD2與順鉑共處理2組細胞，能有效抑制其存活率。結論 NPC腫瘤干細胞CNE-2S高表達SOD2后，抗氧化應激能力增強，從而導致對順鉑的耐藥。

鼻咽癌；腫瘤干細胞；順鉑；耐藥；氧化應激；谷胱甘肽；超氧化物歧化酶；RNA干擾

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）為我國華南地區常見的惡性腫瘤之一，在臨床治療中通常以放療為主并輔以適當的化療［1］。雖然NPC患者經治療后存活率逐年得到提升，但其復發后耐藥性增加是臨床遇到的更大問題。近年來發展起的腫瘤干細胞理論認為，傳統的放化療手段無法完全消除腫瘤，因其僅殺滅了已分化的低致瘤性癌細胞，而殘留的真正致瘤的腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）成為復發和轉移的根源［2］。

CSCs具有天然固有的多藥耐藥性（multidrug resistance，MDR），可通過升高抗氧化應激能力為代表的細胞內解毒能力，對抗順氯氨鉑（cisplatin，CDDP）等一線化療藥物誘導產生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）而逃逸相關的凋亡及壞死［3］。然而針對NPC CSCs的MDR機制依然不清，限制了特異性針對NPC CSCs治療方法的發展。本文通過比較NPC CSCs與母群細胞抗ROS能力及機制的異同，發現在NPC CSCs特異性高表達的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）2基因，并利用小分子RNA干擾技術，在體外初步探索針對SOD2克服NPC CSCs耐藥的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 NPC細胞CNE-2為我教研室長期傳代培養及規范凍存；人NPC細胞CNE-2S為本課題組利用無血清干細胞培養基從CNE-2中用極限稀釋法分離出的細胞亞群，具有腫瘤干細胞的相關特性［4］。DMEM/F12培養基、胎牛血清（FBS）、B-27添加物及TRIzol購自Invitrogen公司；人表皮生長因子（Human epidermal growth factor，hEGF）、人堿性成纖維細胞生長因子（Human Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）購自Cell Signal Technology公司；肝素鈉、CDDP購自Sigma公司；SOD檢測試劑盒及CCK-8細胞增殖毒性檢測試劑盒購自同仁化學研究所；反轉錄試劑盒及SYBR Green定量PCR試劑盒購自寶生物公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和SOD2小鼠抗人單抗購自Abcam公司；SOD2 siRNA（h）購自Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗購自Merck公司，PVDF膜、ECL發光液購自Millipore公司；BCA蛋白定量試劑盒、ROS檢測試劑盒、總谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒、RIPA裂解液、5×蛋白上樣緩沖液購自碧云天生物研究所。7500實時定量PCR為Applied Biosystems公司產品，多功能酶標儀為BioTek公司產品，垂直電泳系統、槽式轉膜系統及冷凝CCD成像系統為Bio-Rad公司產品，FACSCantoⅡ流式細胞分析儀為BD產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將CNE-2置于含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養基中，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養箱中培養。將CNE-2S置于含2%B-27添加物、20 μg/L hEGF、20 μg/L bFGF、10 μg/L肝素鈉、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養基中，于37℃，5%CO2飽和濕度培養箱中培養。每次實驗設3個重復孔，每組實驗重復3次。

1.2.2 CCK-8法測定藥物的殺傷效果 將CNE-2及CNE-2S接種至96孔板正常培養12 h后，棄去原培養基，分別加入含0.01、0.05、0.1、0.5、1、5及10 μmol·L-1CDDP的完全培養基，37℃，5%CO2飽和濕度培養48 h后。參考文獻［5］中的CCK-8法測定各濃度的相對抑制率，利用Origin 8.5軟件回歸后求算半數抑制濃度（IC50）。

1.2.3 細胞內ROS水平檢測 根據所得IC50，選定0.1、0.5 和1 μmol·L-1共3個濃度分別處理2組細胞48 h后，消化細胞，制成單細胞懸液，按說明書裝載DCPH-DA探針于細胞懸液中，37℃細胞培養箱孵育20 min，PBS洗滌3次后，流式細胞儀檢測FL1綠光通道信號。以正常培養的細胞作為對照，利用熒光信號中值反映ROS水平。

1.2.4 細胞內總GSH含量及SOD活性檢測 按實驗分組處理后，消化細胞，制成單細胞懸液計數，每組取1×107個細胞。按說明書通過多功能酶標儀測定412 nm處吸光度，利用動力學測定法求算每組樣品中GSH的含量。測定450 nm處吸光度，利用標準曲線法求算每組樣品SOD的活性。

1.2.5 實時定量PCR測定相關基因的mRNA表達 正常培養及用1 μmol·L-1順鉑處理細胞48 h后，TRIZol法提取總RNA。測得濃度后按PrimeScript RT reagent Kit說明書操作，進行反轉錄；按SYBR Premix Ex TaqⅡKit說明書操作，相關基因［SOD1、SOD2、谷胱甘肽合成酶（glutathione synthetase，GSS）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞基（GCLC）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶調節亞基（GCLM）］引物見表1，在7500實時定量PCR系統上，選用△△Ct相對定量法進行檢測分析，以CNE-2為對照，GAPDH為內參基因，求算各目標基因的相對mRNA表達量。

Tab.1 A list of primers used in the reactions for real-time q-PCR表1 定量PCR檢測相關基因的引物

1.2.6 免疫印跡法檢測SOD2蛋白表達 正常培養及用1 μmol·L-1順鉑處理細胞48 h后，按文獻［6］中方法加入RIPA裂解液裂解細胞，按BCA蛋白定量試劑盒說明書進行蛋白定量，并加入5×蛋白上樣緩沖液。使用SDS-PAGE蛋白電泳系統分離蛋白，濕轉法電轉移至PVDF膜。按抗體說明書要求封閉、孵育抗體，最后加入ECL發光液，置ChemiDoc XRS+成像系統中，檢測化學發光情況。

1.2.7 小RNA干擾 當細胞生長至 70%時，按 Lipofectamine 2000說明書進行小干擾RNA（siRNA）的轉染，轉染前更換細胞培養液為無血清及抗生素的培養基，分別用無血清及抗生素的培養基按比例稀釋Lipofectamine 2000及siRNA（包括si-SOD2及對照siRNA）并混勻，處理細胞6 h后更換為完全培養基，正常培養24 h后進行后續實驗。

1.2.8 臺盼藍染色法計算細胞存活情況 按1.2.7沉默SOD2后加入順鉑繼續培養48 h，消化收集細胞，用臺盼藍染液與細胞懸液等體積混勻，細胞計數板內計數透亮的活細胞及染上藍黑色的死細胞總數，計算細胞存活情況。

2 結果

2.1 順鉑對細胞的毒性檢測 順鉑對CNE-2的IC50為（2.4±0.6）μmol·L-1，低于CNE-2S的IC5（09.8±1.1）μmol·L-1，差異有統計學意義（t=15.33，P＜0.05）。

2.2 細胞內ROS水平的檢測 在對照組及加入梯度濃度的順鉑處理后，CNE-2S的熒光信號均明顯低于CNE-2的熒光信號，見圖1。

Fig.1 Histograms show ROS level in cells treated by cisplatin圖1 不同濃度順鉑處理后細胞內ROS水平比較

2.3 細胞內GSH含量的檢測 對照組中 CNE-2S 與CNE-2的GSH差異無統計學意義（t=0.21，P＞0.05）。用順鉑處理后，2組細胞中GSH水平均有上升，但同一順鉑濃度處理的2組細胞間差異無統計學意義，見圖2。

Fig.2 Histograms show GSH level in cells treated by cisplatin圖2 不同濃度順鉑處理后2組細胞內GSH水平比較

2.4 細胞內SOD活性的檢測 對照組及不同濃度順鉑處理后，CNE-2S細胞的SOD活性均高于CNE-2細胞（P＜0.05），見圖3。

Fig.3 Histograms show SOD level in cells treated by cisplatin圖3 不同濃度順鉑處理后2組細胞內SOD活性比較

2.5 GSS、GCLC、GCLM、SOD1和 SOD2基因的mRNA相對表達情況 正常培養CNE-2S細胞的GSS、GCLC、GCLM和SOD1 mRNA水平與CNE-2細胞無明顯差異（P＞0.05），而CNE-2S組的SOD2 mRNA水平高于CNE-2組（P＜0.05）；1 μmol·L-1順鉑處理后，CNE-2S組的SOD2 mRNA水平高于CNE-2組（P＜0.05），其他基因亦無明顯差異（P＞0.05），見表2、3。

Tab.2 mRNA levels including GSS，GCLC，GCLM，SOD1 and SOD2 in normal cultured cells were examined by real-time q-PCR表2 正常培養的2組細胞內GSS、GCLC、GCLM、SOD1 和SOD2基因的mRNA水平比較 （±s）

Tab.2 mRNA levels including GSS，GCLC，GCLM，SOD1 and SOD2 in normal cultured cells were examined by real-time q-PCR表2 正常培養的2組細胞內GSS、GCLC、GCLM、SOD1 和SOD2基因的mRNA水平比較 （±s）

＊P＜0.05

組別CNE-2組CNE-2S組t SOD1 1.00±0.12 0.97±0.09 0.61 n66 GSS 1.00±0.12 0.96±0.11 0.72 GCLC 1.00±0.09 1.03±0.11 0.57 GCLM 1.00±0.13 1.16±0.17 2.17 SOD2 1.00±0.11 3.02±0.19 26.58＊

Tab.3 mRNA levels including GSS，GCLC，GCLM，SOD1 and SOD2 in cisplatin treated cells were examined by real-time q-PCR表3 1 μmol·L-1順鉑處理后2組細胞內GSS、GCLC、GCLM、SOD1和SOD2基因的mRNA水平比較（±s）

Tab.3 mRNA levels including GSS，GCLC，GCLM，SOD1 and SOD2 in cisplatin treated cells were examined by real-time q-PCR表3 1 μmol·L-1順鉑處理后2組細胞內GSS、GCLC、GCLM、SOD1和SOD2基因的mRNA水平比較（±s）

＊P＜0.05

?

2.6 SOD2蛋白表達情況 CNE-2S的SOD2蛋白水平高于CNE-2，順鉑處理后SOD2蛋白表達量上升，見圖4。沉默SOD2后，si-SOD2組的SOD2蛋白水平低于對照siRNA組，見圖5。

Fig.4 SOD2 protein expressed in cisplatin treated cells，examined by Western blotting圖4 順鉑處理后細胞內SOD2蛋白水平檢測

2.7 沉默SOD2增強順鉑對NPC細胞的殺傷作用 相對于對照siRNA處理，si-SOD2與順鉑聯用能顯著殺傷CNE-2及CNE-2S細胞（P＜0.05），見表4。

Fig.5 SOD2 protein expressed in SOD2 silenced cells，detected by Western blotting圖5 沉默SOD2后細胞內SOD2蛋白水平檢測

Tab.4 Cell viability was detected by trypan blue staining表4 臺盼藍染色法檢測細胞存活情況 （±s）

Tab.4 Cell viability was detected by trypan blue staining表4 臺盼藍染色法檢測細胞存活情況 （±s）

＊P＜0.05

組別CNE-2組CNE-2S組n 66細胞存活率（%）對照siRNA+順鉑32.4±5.2 53.2±8.3沉默SOD2+順鉑13.7±4.1 39.4±6.7 t 7.73＊12.86＊

3 討論

眾多研究證明，NPC組織和細胞中存在CSCs，且CSCs具有持續的自我更新能力、更強的體內致瘤性及耐藥性增強等特性［7-8］。CSCs能通過多種機制產生MDR，包括：增強藥物外排能力，增強細胞解毒能力，增強DNA修復能力，激活抗凋亡相關信號通路等［9］。本研究發現，利用懸浮培養法從NPC細胞CNE-2中分離得到的具有CSCs特性的CNE-2S細胞，對順鉑具有更強的耐受能力，且具有更強的ROS消除能力。在NPC的放化療治療過程中，化療藥物和放射線能誘導細胞產生大量的ROS，無法被清除的ROS能破壞細胞內生物大分子，進而通過多種途徑導致細胞凋亡，這是放化療殺滅腫瘤細胞的作用機制之一［10］。

GSH是一種含巰基活性三肽，能作為底物與順鉑等抗腫瘤藥物結合，或直接與自由基等反應而發揮解毒作用［11］。本研究發現，雖然順鉑能誘導CNE-2S與CNE-2細胞內產生更多的GSH，但同一順鉑濃度作用下，2組細胞內GSH的含量并無明顯差別，提示雖然順鉑能誘導腫瘤細胞增加GSH，但與NPC腫瘤干細胞耐藥無直接關系。為進一步從基因調控水平驗證此推斷，本研究用實時定量PCR技術檢測了與GSH合成有關的3個基因GSS、GCLC和GCLM的表達情況。結果顯示，順鉑能誘導2組細胞上調GSH合成相關基因的轉錄，但CNE-2S與CNE-2間無明顯差異。筆者初步推測NPC腫瘤干細胞群CNE-2S相對于母群細胞對抗順鉑殺傷作用的增強，可能為非依賴GSH的機制。

SOD是生物體內重要的抗氧化酶，能夠催化超氧化物通過系列反應最終生成氧氣和水，從而保護細胞免受ROS的損害［12］。本研究發現，順鉑能誘導NPC細胞內總SOD的活性增強，且CNE-2S細胞內SOD的活性高于母群細胞CNE-2，提示NPC腫瘤干細胞耐藥特性可能與細胞高表達SOD有關。人體細胞中的SODs包括3種同工酶：位于胞漿的銅鋅超氧化物歧化酶（Cu-Zn-SOD，SOD1），位于線粒體的錳超氧化物歧化酶（MnSOD，SOD2）和分泌到細胞外的細胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD，SOD3）。為了從基因調控水平驗證SOD與NPC腫瘤干細胞耐藥有關，本研究進一步檢測了SOD1、SOD2基因的mRNA水平，發現順鉑能上調SOD2的轉錄及翻譯，對SOD1的轉錄并無顯著影響，且CNE-2S相對于CNE-2高表達SOD2，免疫印跡對SOD2蛋白表達水平的驗證與mRNA水平結果一致。此外，Feng等［13］通過蛋白質組學分析提出，通過檢測腫瘤組織中SOD2表達量能對患者放療效果進行預測。綜上結果表明，具有CSC特性的CNE-2S細胞可能通過高表達SOD2抑制了順鉑誘導的ROS，從而增強了對順鉑的抗殺傷作用。

為初步探討抑制SOD2能否逆轉CNE-2S對順鉑的耐藥，本研究利用siRNA技術沉默2種NPC細胞中SOD2的表達，并聯用順鉑處理細胞后發現，沉默SOD2能增強順鉑對NPC腫瘤干細胞及母群細胞的殺傷作用。此外，Qu等［14-15］分別通過微小RNA （microRNA）及小發夾RNA（shRNA）技術沉默NPC細胞中CNE-1及CNE-2的SOD2表達，均能增強發射線對2組細胞的殺傷作用。綜上實驗結果顯示，特異性沉默SOD2能增強放化療對NPC細胞的殺傷。但本研究結果顯示，沉默SOD2并不能完全逆轉CNE-2S對順鉑的敏感，提示SOD2的過表達雖是NPC腫瘤干細胞CNE-2S對順鉑耐藥的機制之一，但可能還有其他機制。

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（2014-12-05收稿 2015-02-12修回）

（本文編輯 閆娟）

Nasopharyngeal carcinoma stem cells develop resistant against Cisplatin through upregulating SOD

LIN Bihua1，CHEN Jing2，GUO Chunlian3，YU Haibo4，ZHANG Xin5，ZHOU Keyuan1，5△
1 Department of Biochemistry and Molecular Biology，Guangdong Medical College，Dongguan，Guangdong 523808，China；2 Department of Pharmacy，Dongguan People's Hospital；3 Department of Pharmacology，Guangdong Medical College，Dongguan；4 Centre for Tender and Bidding，Guangdong Medical College；5 Key Laboratory for Medical Molecular Diagnostics of Guangdong Province
△Corresponding Author Email:kyz009@126.com

Objective To investigate the way that nasopharyngeal carcinoma（NPC）and NPC stem cells develops resistance to cisplatin through anti-reactive oxygen species mechanism.Methods Using CCK-8 cell counting kit，we measured the half inhibitory concentration of cisplatin against NPC cells"CNE-2"and NPC stem cells"CNE-2S"，and compared their resistant index.We examined the differences in the reactive oxygen species（ROS）levels，total glutathione（GSH）levels，and total superoxide dismutase（SOD）levels between CNE-2 and CNE-2S at different concentrations of cisplatin administration（0.1，0.5 and 1.0 μmol·L-1）.Using q-PCR，we determined the mRNA expression level of GSS，GCLC，GCLM，SOD1 and SOD2 after 48 hours administration of cisplatin at 1 μmol·L-1.Protein expression level of SOD2 was also tested using Western Blot after 48 hours administration of cisplatin at 1 μmol·L-1.Upon silencing the SOD2 in NPC cell through siRNA，Trypan blue was used to analyze cell survival after cisplatin was administrated at 1 μmol·L-1.Results The inhibition concentration of cisplatin against CNE-2 was higher than that against CNE-2S（μmol·L-1：9.8±1.1 vs 2.4±0.6，P＜0.05）.ROS levels in CNE-2 and CNE-2S both rise with cisplatin administration，but ROS levels of CNE-2 before and after cisplatin treatment were both higher than those in CNE-2S（P＜0.05）.The total glutathione levels in CNE-2 and CNE-2S were both increased after 1 μmol·L-1cisplatin treatment but there is no significant difference in levels of glutathione between these two cell lines.After treated with cisplatin，SOD level were increased in both CNE-2S and CNE-2，but it is higher in CNE-2S than that in CNE-2（P＜0.05）.The mRNA levels of GSS，GCLC，GCLM，and SOD1 were not different significantly between in CNE-2 and in CNE-2S with or without cisplatin treatment.However，SOD2 in CNE-2S were higher than that in CNE-2 on both mRNA and protein levels（P＜0.05）.Silenced SOD2 disrupted the resistance of cisplatin in CNE-2S.Conclusion These data suggest that NPC stem cells（CNE-2S）enhance its drug resistance to cisplatin through highly expression of SOD2 which posed anti-ROS capacity.

nasopharyngeal carcinoma；cancer stem cells；Cisplatin；drug resistance；reactive oxygen；glutathione；superoxide dismutase；RNA interference

R739.6

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.001

國家自然科學基金資助項目（81272434）；湛江市科技攻關計劃（2013B01091）；廣東醫學院青年基金（Q2012005）；國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201310571004）；廣東省大學生創新創業訓練計劃項目（1057113030）；廣東醫學院大學生創新實驗項目立項（ZZDM012，ZZDM013）

1廣東醫學院生物化學與分子生物學教研室（郵編523808）；2東莞市人民醫院；3廣東醫學院藥劑學教研室；4廣東醫學院招投標中心；5廣東省醫學分子診斷重點實驗室

林碧華（1982），女，碩士，主要從事中藥小分子抗腫瘤機制研究

△E-mail:kyz009@126.com