重型顱腦創傷大鼠后期腦水腫研究及牛磺酸轉運體的作用

蔡英，黃慧玲，范維佳，武俏麗，李曉茜，蘇彥華，溫曉昶

重型顱腦創傷大鼠后期腦水腫研究及牛磺酸轉運體的作用

蔡英，黃慧玲△，范維佳，武俏麗，李曉茜，蘇彥華，溫曉昶

目的 研究牛磺酸轉運體（TauT）在牛磺酸調節重型顱腦創傷大鼠后期腦水腫中的作用。方法 將40只大鼠按隨機數字表法分為4組:假手術組（Sham組）、腦外傷組（TBI組）、牛磺酸預防組（Pre-Tau組）和牛磺酸治療組（Tau組）。液壓沖擊法制作重型顱腦創傷大鼠模型。Pre-Tau組和Tau組分別在造模前或后給予120 g/L的牛磺酸溶液，其他兩組給予等量的等滲生理鹽水。7 d后用干濕重法檢測腦組織中腦水含量，實時熒光定量PCR和Western Blot方法檢測TauT和水通道蛋白（AQP4）的mRNA表達及蛋白含量。結果 與Sham組相比，TBI組腦水含量、AQP4的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高，TauT的mRNA和蛋白表達水平顯著降低。與TBI組比較，Pre-Tau組和Tau組腦水含量、AQP4的mRNA和蛋白表達水平顯著降低、TauT的mRNA表達明顯升高；Tau組TauT的蛋白表達明顯升高；Pre-Tau組TauT的蛋白表達有所升高，但差異無統計學意義。AQP4的mRNA和蛋白表達水平與腦水含量呈正相關（r分別為0.621和0.457），AQP4的mRNA與蛋白表達亦呈正相關（r=0.459）。結論 牛磺酸通過提高重型顱腦創傷大鼠后期TauT的表達水平，降低腦水含量和AQP4的表達，發揮神經元保護作用。

牛磺酸；腦損傷；膜轉運蛋白質類；腦水腫；水通道蛋白質4；大鼠，Sprague-Dawley；牛磺酸轉運體

牛磺酸（taurine，Tau）是神經系統發育、維持功能所不可缺少的氨基酸，具有抑制性遞質的作用［1-2］。細胞內高濃度的牛磺酸水平是其發揮作用的基礎，牛磺酸轉運體（taurine transporter，TauT）逆濃度梯度將血漿中牛磺酸跨膜主動轉運至細胞內聚集是形成細胞內高濃度牛磺酸的主要方式。重型顱腦創傷（severe traumatic brain injury，sTBI）是神經外科常見的疾病，具有很高的致死率和致殘率［3］。腦水腫引起的顱內壓增高是顱腦創傷后最重要的病理反應［4］。水通道蛋白4（AQP4）是哺乳動物腦內最主要的水通道蛋白，與腦脊液的產生和重吸收有關，在腦水腫的形成過程中起關鍵性作用［5-6］。本課題組前期研究發現，Tau具有顯著改善顱腦創傷大鼠腦血流、血液凝固狀態和代謝紊亂等腦保護作用［7］。本實驗應用Tau治療和預防TBI，觀察TBI后期的腦水腫等情況，旨在進一步闡明Tau對TBI大鼠的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗用品

1.1.1 試劑 牛磺酸（美國Sigma公司），RNA提取試劑、熒光定量PCR擴增試劑盒、逆轉錄酶M-MLV和RNA酶抑制劑（美國Life Technologies公司），總蛋白提取試劑盒和BCA法蛋白定量試劑盒（美國Thermo公司），羊抗TauT多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），兔抗AQP4抗體（美國Abcam公司），β-actin抗體（美國Biotech公司），HRP標記二抗（北京中杉金橋公司），ECL熒光化學發光試劑盒（美國Millipore公司）。其余試劑均為國產分析純。

1.1.2 儀器 DY-1型動物腦立體定位儀（天津市醫療器械研究所），液壓腦創傷打擊儀（美國弗吉尼亞大學），Strong 90型電動磨鉆（韓國Sae Shin Precision公司），UNICAM UV 300型紫外分光光度計（美國Thermo公司），Avanti-30型臺式高速低溫離心機（美國Beckman公司），Miniprotean Tetra Cell型電泳系統、Mini Trans-Blot Cell型轉膜系統和CFX384型實時熒光定量PCR儀（美國BIO-RAD公司），Gene genius型凝膠成像及分析系統（美國Syngene公司）。

1.1.3 實驗動物 清潔級SD雄性大鼠40只，購自軍事醫學科學院實驗動物中心［許可證號：SCXK-（軍）2012-0004］，體質量（290±20）g。按照隨機數字表法分為假手術組（Sham組）、腦外傷組（TBI組）、牛磺酸預防組（Pre-TBI組）和牛磺酸治療組（Tau組），每組10只。實驗中死亡或不符合標準的大鼠均重新造模補齊。

1.2 實驗方法

1.2.1 顱腦創傷模型制作及分組 根據文獻［7］的方法制作大鼠TBI模型：經腹腔注射水合氯醛麻醉動物，將頭部固定于動物腦立體定位儀。頭部消毒后正中切開2 cm，剝離骨膜，在顱骨前囟左后4.5 mm、矢狀縫左旁2.5 mm鉆一直徑為5 mm的骨窗。將無菌打擊管兩端分別固定于骨窗和液壓腦創傷打擊儀的沖擊嘴，調節壓力為1.8個標準大氣壓，進行液壓打擊，制作重型顱腦創傷大鼠模型。

1.2.2 牛磺酸溶液的配制及給藥 將2 400 mg牛磺酸溶于15 mL等滲鹽水中，充分溶解后用NaOH調節pH值至7.0，定容為20 mL，制成120 g/L的牛磺酸溶液，在無菌室內經0.25μm濾器過濾后保存備用。Sham組，只開骨窗，不打擊，尾靜脈即刻注射0.5 mL等滲鹽水，并連續注射7 d。TBI組，用液壓打擊儀制作sTBI模型，造模成功后，尾靜脈即刻注射0.5 mL等滲鹽水，連續7 d。Pre-Tau組和Tau組分別在造模前連續4 d或造模成功后連續7 d給予尾靜脈注射牛磺酸溶液。

1.2.3 腦組織含水量測定 實驗動物于7 d后斷頭處死，迅速在冰上取傷側（左側）大腦組織，將皮質表面軟腦膜剔除干凈，濾紙吸干表面水分及血漬，取損傷區前緣約30 mg腦組織稱濕質量后放入電熱恒溫干燥箱內105℃烤24 h至質量恒定，稱干質量（兩次干質量差應＜0.000 2 g）。根據Eliot公式計算腦組織含水量：腦組織含水量=（濕質量-干質量）/濕質量×100%。剩余傷側腦組織液氮研磨成粉末，-80℃冰箱保存備用。

1.2.4 實時熒光定量PCR法檢測腦組織中TauT和AQP4基因表達量 按照TRIzol Reagent試劑說明書提取腦組織總RNA。用紫外分光光度計和甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度、純度和完整性。取2 μg總RNA按照逆轉錄酶MMLV說明書反轉錄成cDNA，-20℃冰箱保存備用。采用Gene Runner軟件進行引物設計，經Blast檢索無同源性，由北京Life Technologies生物技術公司合成。TauT基因引物序列：上游5′-418GAGGTCATCATAGGCCAGTAC438-3′，下游5′-537GTACACATTCAGGAGGGACAC507-3′，擴增產物為120 bp；AQP4引物序列為：上游5′-253GTTCAGTGCTTCGGCCACAT272-3′，下游5′-362GCAGTGATGTAGAAGACGGACTT340-3′，擴增產物為 110 bp；β-actin基因引物序列：上游 5′-410GAACCCTAAGGCCAACCGTG429-3′，下游5′-514AGGCATACAGGGACAACACAG493-3′，擴增產物為105 bp。用實時熒光定量PCR儀檢測TauT和AQP4的mRNA表達，以β-actin為內參。20μL PCR反應體系為：10μL的2×SYBR GREEN MIX，上下游引物（10 μmol/L）各1μL，1μL的cDNA，補充ddH2O至20μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min；94℃變性15 s，退火15 s，72℃延伸15 s，循環40次；最后72℃延伸5 min。TauT、AQP4和β-actin的退火溫度分別為62℃、60℃和55℃。樣本目的基因的相對表達量計算公式為：相對表達量=2-△Ct（△Ct=Ct1-Ct2；Ct1：樣品待測基因的臨界循環數；Ct2：樣品管家基因的臨界循環數）。

1.2.5 Western Blot法檢測腦組織中TauT和AQP4蛋白表達量 按照總蛋白提取說明書抽提腦組織總蛋白：取500 mg液氮研磨的腦組織粉末放入勻漿器中球狀部位，加入0.5 mL的總蛋白提取試劑，于勻漿器中進行勻漿。然后置于冰上。重復碾幾次使組織盡量碾碎。裂解30 min后，用移液器將裂解液移至1.5 mL離心管中，然后在4℃下12 000 r/min離心5 min，取上清分裝于0.5 mL離心管中并置于-20℃保存，此為提取的腦組織總蛋白。BCA法定量后用蛋白溶解液調整蛋白濃度為5 g/L，取40μg總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），切取包含TauT（64 ku）、AQP4（34 ku）或β-actin（42 ku）的凝膠進行轉膜，110 V，90 min，用5%脫脂奶粉封閉2 h，按照分子質量大小剪開硝酸纖維素（NC）膜后，分別加入TauT（1∶200）、AQP4（1∶500）或β-actin（1∶1 000）抗體，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次2 mL，洗滌5 min。加入HRP標記的二抗（1∶500）常溫孵育2 h。棄掉二抗，再次TBST洗膜3次。加入1 mL ECL發光液與膜充分接觸，于成像系統進行圖像采集。樣本中目的蛋白的相對表達量為目的蛋白條帶與內參β-actin蛋白條帶凈吸光度值的比值。

1.3 統計學方法 應用SPSS 13.0錄入數據并進行統計學分析，數據均以±s表示，用Kolmogorov-Smirnov法檢驗數據的正態分布情況，如符合則采用單因素方差分析（Oneway ANOVA），多重比較采用LSD-t法，相關性分析采用Pearson相關分析法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦水含量檢測 與Sham組相比，TBI組腦水含量顯著升高，Pre-Tau組和Tau組腦水含量與TBI組比較明顯降低（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Water content，mRNA transcription and protein expression levels of TauT and AQP4 in injured cerebral hemisphere in all four groups表1 牛磺酸治療后傷側大腦組織腦水含量、TauT和AQP4的mRNA及蛋白表達情況（n=10，±s）

Tab.1 Water content，mRNA transcription and protein expression levels of TauT and AQP4 in injured cerebral hemisphere in all four groups表1 牛磺酸治療后傷側大腦組織腦水含量、TauT和AQP4的mRNA及蛋白表達情況（n=10，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與TBI組比較，P＜0.05

?

2.2 AQP4和TauT的mRNA及蛋白表達 與Sham組相比，TBI組腦組織AQP4 mRNA及蛋白表達量顯著升高，TauT mRNA及蛋白表達量均顯著降低（P＜0.05）。與TBI組比較，Pre-Tau組和Tau組AQP4 mRNA及蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；Tau 組TauT mRNA及蛋白表達量比TBI組明顯升高（P＜0.05），Pre-Tau組的TauT mRNA表達量明顯升高（P＜0.05），見圖1、表1。

2.3 AQP4 mRNA和蛋白表達與腦水含量的相關性分析 AQP4的mRNA和蛋白表達水平與腦水含量呈正相關（r分別為0.621和0.457，P＜0.05），AQP4 的mRNA與蛋白表達亦呈正相關（r=0.459，P＜0.05）。

Fig.1 TauT and AQP4 protein expression levels in the injured cerebral hemisphere in all four groups圖1 牛磺酸治療后傷側腦組織TauT和AQP4蛋白表達

3 討論

牛磺酸以毫摩爾量分布于腦組織中，通過TauT介導，選擇性攝入和釋放牛磺酸，發揮神經元保護功能。牛磺酸轉運至細胞內可以被牛磺酸轉運體抑制劑2-胍基乙磺酸（GES）所抑制，使細胞內的牛磺酸濃度大大降低［8］，TauT-/-小鼠的多個組織牛磺酸含量大大降低［9-10］。因此，牛磺酸作用的發揮依賴于TauT數量和結構的正常。本實驗在sTBI后尾靜脈注射牛磺酸可以有效誘導腦組織TauT的mRNA和蛋白表達，說明在病理情況下，外源性牛磺酸能夠增強腦細胞膜上TauT的表達以維持細胞內Tau的生理濃度，與文獻報道一致［11］。在本實驗中，預防性地應用牛磺酸也可有效提高腦組織TauT的mRNA表達量，其機制可能是細胞外高濃度的牛磺酸使細胞處于一種“活化”的狀態，能夠隨時對外界刺激如腦外傷做出應答以保護機體，這可能是機體的一種儲備功能。Pre-Tau組TauT蛋白的表達與TBI組比較有升高的趨勢，但是差異無統計學意義，其原因可能是大鼠在未受到TBI損傷時，給予尾靜脈注射牛磺酸，雖然增加了血液中的牛磺酸濃度，使細胞處于一種“活化”的狀態，但是并不能改變機體內TauT蛋白的正常水平。此時的大鼠在受到腦外傷時，停止了外源性牛磺酸溶液的供給，只能依靠“活化”的細胞誘導TauT mRNA的高表達，在TBI后翻譯出大量的TauT蛋白，使血漿中的牛磺酸轉運到細胞內，發揮牛磺酸的神經元保護作用，降低腦水腫。但細胞內高水平的牛磺酸可反饋性地抑制TauT的表達［12］，使預防組的TauT蛋白表達量下降。

AQP4作為腦組織內含量最為豐富的水通道蛋白，參與介導水分子的跨膜轉運和離子平衡，在腦內水平衡的調節上起主要作用［13］，與腦水腫的發生密切相關。Qing等［14］檢測了大鼠腦出血后腦水含量和腦組織AQP4 mRNA的表達情況，結果顯示腦水含量和AQP4 mRNA在腦出血1 d即有升高，3 d達到峰值，7 d和14 d仍在高水平，且AQP4 mRNA的表達和腦水含量呈正相關關系。說明AQP4在腦水腫的形成過程中起重要作用。

國內外關于TBI后腦水腫的文獻多集中在TBI后的早期即12 h、24 h、48 h或72 h［15-16］，TBI后期（7 d）的腦水腫情況少有報道。Oliva等［17］報道中度TBI 后7 d大鼠傷側皮質AQP4的蛋白表達水平較Sham組顯著下降，海馬AQP4的蛋白表達水平沒有顯著性變化，而本研究結果顯示重度TBI后7 d大鼠傷側大腦半球的AQP4的蛋白表達水平較Sham組顯著上升，與上述文獻結果不同。其原因一是由于Oliva等的動物模型為中度TBI模型，本研究動物模型為重度TBI模型；二是檢測部位不同，Oliva等分別檢測傷側的皮質和海馬，本研究為傷側大腦半球。這就說明AQP4在不同的實驗模型、不同的組織部位具有不同的表達情況。

本研究結果顯示，sTBI組的腦水含量與AQP4 的mRNA和蛋白表達都升高，說明AQP4參與了重型顱腦創傷性腦水腫的發生發展過程。牛磺酸預防與治療可以有效降低TBI后7 d腦水含量與AQP4 的mRNA和蛋白表達量。這與筆者前期對腦外傷后早期24 h的研究結果一致［7］，說明牛磺酸具有防止TBI后腦水腫的作用。機制可能是TBI后繼發創傷性腦水腫，引起細胞內外的滲透壓不平衡，細胞外的高滲狀態通過誘導牛磺酸轉運體的表達［18］，使牛磺酸轉運到細胞內。細胞內牛磺酸濃度升高不僅可以通過穩定細胞膜、清除自由基、抗脂質過氧化等功能來減輕腦水腫的程度，從而間接調節AQP4的mRNA和蛋白表達量；還可以通過某些環節抑制AQP4的轉錄和翻譯過程，從而直接降低AQP4的mRNA和蛋白表達。

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（2015-01-08收稿 2015-03-05修回）

（本文編輯 魏杰）

Protection role of taurine transporter in rats brain edema followed severe traumatic head injury

CAI Ying，HUANG Huiling△，FAN Weijia，WU Qiaoli，LI Xiaoqian，SU Yanhua，WEN Xiaochang
Tianjin Huanhu Hospital，Neurosurgery Institute of Tianjin，Tianjin Cerebrovascular and Neurodegeneration Key Laboratory，Tianjin 300060，China
△Corresponding Author E-mail：huanghuiling@126.com

Objective To investigate the effect of taurine transporter in the process of protection of brain edema in rats with severe traumatic head injury.Methods A total of 24 Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 4 groups.Except the control rats（Group Sham），all other three groups were subjected to lateral fluid percussion head injury.The TBI （Traumatic brain injury）models（Group TBI）and surgical control rats（Group Sham）were injected with saline through caudal vein after surgery，while the Taurine prevention and Taurine treatment models（Group Pre Tau and Group Tau）were injected with 120 g/L taurine solution before or after surgeries respectively.Water content in each brain，mRNA and protein expression of aquaporin 4 and taurine transporter in the injured rat brain hemispheres were all evaluated over the time course of the study（7 d）in each group.Results Compared with rats in Group Sham，water content in each brain increase，mRNA transcription and protein expression of AQP4 were both up regulated but the mRNA transcription and protein expression of TauT were both down-regulated in rats in TBI group.Compared with rats in TBI group，brain water content，mRNA transcription and protein expression of AQP4 all decrease while mRNA transcription and protein expression of TauT all increase in rats in Pre tau and Tau groups.There is no statistical difference of TauT expression between rats in pre-tau group and Tau group.Conclusion Taurine exert its neuron protection role through draining water content from brain and down regulating expression of AQP4 but rising expression of TauT after TBI.

Taurine；brain injuries；membrane transport proteins；brain edema；aquaporin 4；rats，Sprague-Dawley；taurine transporter

R651.15

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.008

國家自然科學基金資助項目（30973089）；天津市應用基礎及前沿技術研究計劃項目（10JCYBJC23200）；天津市衛生局科技基金項目（2012KR09）

天津市環湖醫院，天津市神經外科研究所，天津市腦血管與神經變性重點實驗室（郵編300060）

蔡英（1978），女，碩士，助理研究員，主要從事神經系統損傷與修復方面研究

△E-mail：huanghuiling@126.com