大鼠骨髓間充質干細胞的分離鑒定及免疫調節性能初探

張志強，劉義，李克秋，李光

大鼠骨髓間充質干細胞的分離鑒定及免疫調節性能初探

張志強，劉義，李克秋，李光△

目的 分離培養大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs），鑒定其向脂肪細胞和軟骨細胞的分化潛能，并探討其免疫調節性能。方法 無菌條件下摘取Sprague-Dawley（SD）大鼠股骨和脛骨，全骨髓貼壁法培養BMSCs，胰酶消化傳代培養。待培養至第3代時進行流式鑒定，檢測分離的BMSCs分化為脂肪細胞的潛能。與Wistar大鼠脾臟來源T細胞進行共培養，分為直接接觸組和Transwell共培養組，探討其對T細胞亞群的影響，并研究其相關機制。結果BMSCs呈梭形生長，生長至第3代的細胞經檢測發現幾乎不表達CD34和CD45，高表達CD29、CD44和CD90，且經誘導后細胞可分化為脂肪細胞和軟骨細胞。與脾臟來源T細胞共培養可有效降低CD8+的效應T細胞（Teffs）的比例，并且增加CD4+CD25+雙陽性的調節性T細胞（Tregs）數量，具有一定的免疫調節性能。與T細胞共培養后BMSCs 的IL-10和TGF-β1基因表達顯著增強，其中與T細胞直接接觸組效果更為明顯。結論 BMSCs可能通過直接接觸以及分泌細胞因子來發揮免疫調節功能。

骨髓；間質干細胞；細胞分化；神經免疫調節；大鼠，Sprague-Dawley；大鼠，Wistar

骨髓間充質干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）為一群來自骨髓的多潛能干細胞，具有良好的再生和分化能力［1］。BMSCs起源于中胚層間質，具有多向分化的能力［2］。利用其貼壁生長特性可方便地進行體外培養和擴增，體外培養的BMSCs呈梭形，可聚集成均勻的集落［3］。有研究指出，BMSCs還具有良好的免疫調節性能，可通過細胞因子分泌和（或）細胞-細胞直接接觸等對機體免疫系統的T細胞［4］、樹突狀細胞［5］、自然殺傷細胞［6］等產生影響，在免疫學研究領域具有廣泛的應用前景。本研究用全骨髓貼壁法分離培養SD大鼠的BMSCs，通過流式檢測和誘導分化方法鑒定，并且與異基因的Wistar大鼠脾臟來源的T細胞進行共培養，研究BMSCs對T細胞重要亞群的影響，并明確其作用機制，初步探討BMSCs的免疫調節特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康SPF級成年雄性SD和Wistar大鼠，8～9周齡，體質量200～220 g，各3只，購于北京軍事醫學科學院實驗動物中心。

1.1.2 材料和試劑 胎牛血清（FBS）、胰酶購自以色列Bioind公司；αMEM培養基、RPMI 1640培養基購自美國Corning公司；4%多聚甲醛、紅細胞裂解液購自北京索萊寶科技有限公司；間充質干細胞成脂、成軟骨誘導培養基、TRIzol、cDNA第一鏈合成試劑盒購自美國Invitrogen公司；油紅O和甲苯胺藍購自美國Sigma-Aldrich公司；Transwell小室購自美國Millipore公司；流式標記熒光抗體購自美國eBioscience公司；PCR檢測引物合成于北京奧科生物技術有限責任公司；熒光實時定量PCR試劑盒購自瑞士Roche公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 骨髓細胞的分離 無菌條件下分離SD大鼠的脛骨和股骨，剔除干凈肌肉，用注射器吸取含20%FBS的αMEM培養基沖出骨髓腔中的細胞，收集細胞并于室溫1 200 r/min離心5 min，棄掉上清，用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次，再次離心5 min后以1×106個/mL密度接種于培養皿中，于37℃、5%CO2環境的培養箱中培養，每3 d換液1次。

1.2.2 BMSCs的培養 用胰酶消化法進行BMSCs的常規傳代培養。分離的骨髓細胞在培養至6～7 d時達到約80%融合，吸棄培養基并用無菌PBS清洗1次，加入1 mL 0.025%胰酶，37℃消化5 min后以1∶2比例進行傳代，此為第1代BMSCs，隨后約3 d傳代1次，待培養至第3代時進行后續實驗。

1.2.3 流式細胞儀檢測BMSCs表面分子 培養至第3代的BMSCs由胰酶消化成單細胞，按每管5×105個細胞分成6組樣品，PBS清洗1次，以異硫氰酸熒光素（FITC）標記的抗大鼠CD34、CD44、CD45、CD90和棗紅蛋白（PE）標記的抗大鼠CD29抗體，分別標記5組細胞，4℃避光孵育30 min后用PBS清洗2次，用流式細胞儀進行檢測，未標記的BMSCs作為流式檢測設門對照。

1.2.4 BMSCs體外誘導分化 將培養至第3代的BMSCs以每孔1×105個細胞接種于12孔板的3個孔中，待細胞生長至80%融合時棄去培養基，其中一孔加入成脂誘導培養基，另一孔加入成軟骨誘導培養基，剩余一孔作為正常培養對照。每3 d換液1次，約14 d時成脂誘導的細胞內出現明顯的脂滴，成軟骨誘導的細胞融合成小球形狀。棄掉培養基，以4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS清洗后分別加入油紅O和甲苯胺藍染液，室溫染色20 min，PBS清洗后于光學顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.5 Wistar大鼠脾臟T細胞分離 無菌條件下摘取Wistar大鼠脾臟，用眼科剪剪成1 mm3的小塊，置于40 μm孔徑的篩網上，玻璃注射器內芯輕輕碾磨組織，并用無菌PBS沖洗收集細胞懸液，室溫1 500 r/min離心5 min后棄去上清，用1 mL PBS重懸細胞，隨后加入3 mL紅細胞裂解液混勻，4℃孵育15 min后加入30 mL PBS室溫離心5 min，棄去上清，再用PBS清洗后將細胞以（5～10）×105個/mL密度接種于培養皿，用含10%FBS的RPMI1640培養基進行懸浮培養。

1.2.6 BMSCs與T細胞共培養 將培養至第3代的BMSCs與新鮮提取的脾臟T細胞以1∶2比例進行共培養，分兩種模式：一種為直接接觸型，即BMSCs與T細胞共同接種于培養板孔中；另一種以Transwell小室（8 μm孔徑）隔開BMSCs（小室中）和T細胞（培養板中），在RPMI 1640培養基中共培養48 h，BMSCs和T細胞單獨培養作為對照組，分別收集BMSCs和T細胞用于后續檢測。

1.2.7 流式細胞儀檢測與BMSCs共培養后T細胞分型的變化 將經過兩種共培養方式處理的T細胞各分為2組，一組加入PE標記的抗大鼠CD8抗體，另外一組加入FITC標記的抗大鼠CD4抗體和PE標記的抗大鼠CD25抗體，4℃避光孵育30 min后用PBS清洗2次，用流式細胞儀進行檢測，未標記的新鮮T細胞作為流式檢測設門對照。

1.2.8 與 T細胞共培養前后BMSCs基因表達檢測 用TRIzol提取單獨培養及與T細胞混合培養的BMSCs的總RNA，經cDNA第一鏈合成試劑盒反轉錄為cDNA，利用Real-time PCR方法檢測細胞的白細胞介素-10（IL-10）和轉化生長因子-β1（TGF-β1）的表達水平，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）水平為基因表達內參，每個樣品設3次重復。引物序列見表1。

Tab.1 The primers used in Real-time PCR examination in ex vivo study表1 體外實驗中Real-time PCR檢測所用的引物

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行數據分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 流式細胞儀檢測BMSCs表面標志物 培養至第3代的BMSCs表面CD29、CD44和CD90表達均在80%以上，為高水平表達分子；CD34和CD45表達均低于2%，為低表達水平分子，見圖1。

2.2 BMSCs體外誘導鑒定 （1）體外誘導BMSCs向脂肪細胞分化的過程中，細胞形態發生比較明顯變化，由最初呈梭形生長（圖2A）逐漸變圓。加入誘導培養液6 d時即可在光鏡下看到細胞內出現脂滴，隨著誘導時間延長，細胞內的脂滴逐漸增多，有的發生融合，形成較大的脂滴。待誘導到14 d時，BMSCs向脂肪細胞分化達到高峰，經油紅O染色后可見細胞內出現很多圓形、大小不一的脂滴，證實向脂肪細胞的誘導分化成功，見圖2B。（2）誘導BMSCs向軟骨細胞分化過程中，BMSCs由原來的長梭形變為三角形或不規則形，隨著誘導時間的延長，細胞間緊密接觸并逐漸融合成球形，14 d時甲苯胺藍染色顯示細胞內蛋白聚糖陽性，證實向軟骨細胞的誘導分化成功，見圖2C。

2.3 BMSCs對脾臟T細胞分型的影響 BMSCs與異基因脾臟T細胞共培養后，BMSCs&T Transwell組脾臟Teffs細胞比例與BMSCs組相比降低14.27%，BMSCs&T直接接觸組與 BMSCs組相比降低27.72%，見圖3A；此外，BMSCs可顯著增加Tregs細胞的數量，BMSCs&T Transwell組與BMSCs組相比增加180.92%，且這種效應在BMSCs&T直接接觸組中更加明顯，較BMSCs組增加231.30%，見圖3B。

Fig.1 The surface markers of rat BMSCs detected by flow cytometry圖1 流式細胞儀檢測大鼠BMSCs表面標記

Fig.2 The adipocyte and cartilage differentiation capacity of BMSCs圖2 BMSCs向脂肪和軟骨細胞分化的鑒定

Fig.3 The surface markers of spleen T cells and it co-culture with BMSCs for 48 hours detected by flow cytometry圖3 流式細胞儀檢測與BMSCs共培養48 h后的脾臟T細胞表面標記

2.4 BMSCs與脾臟T細胞共培養前后細胞因子表達變化 單獨培養的BMSCs表達一定水平的IL-10 和TGF-β1基因，與異基因脾臟T細胞共培養后可有效增強這2種細胞因子的水平，并且在BMSCs與T細胞直接接觸組中效果更強，見表2。

Tab.2 The relative transcription levels of IL-10 and TGF-β1 in rat BMSCs examined by Real-time PCR表2 Real-time PCR檢測大鼠BMSCs的IL-10和TGF-β1的相對表達量 （n=3，±s）

Tab.2 The relative transcription levels of IL-10 and TGF-β1 in rat BMSCs examined by Real-time PCR表2 Real-time PCR檢測大鼠BMSCs的IL-10和TGF-β1的相對表達量 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與BMSCs組比較，P＜0.05

組別BMSCs組BMSCs&T Transwell組BMSCs&T直接接觸組F TGF-β1 0.701±0.787 0.948±0.659 1.184±0.130a6.389＊IL-10 0.791±0.716 1.340±0.896a1.617±1.753a12.057＊＊

3 討論

3.1 間充質干細胞的多潛能性 間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類多潛能干細胞，在體內各組織如骨髓、脂肪、骨骼肌等均有分布，尤其是骨髓來源的間充質干細胞（BMSCs）易于分離培養，增殖能力強，在體內外均能向多胚層來源的組織細胞分化［7］，能分泌多種細胞因子，是一種非常有應用前景的種子細胞［8］。本實驗成功分離得到SD大鼠的BMSCs，在體外培養中呈梭形生長，增殖快速，經流式細胞儀檢測發現，培養至第3代的BMSCs高表達CD29、CD44和CD90分子，而幾乎不表達造血系的CD34和CD45分子，證實所獲得的BMSCs為典型的間充質干細胞。經誘導培養基處理，BMSCs在體外可高效地向脂肪細胞和軟骨細胞分化，證實其具有良好的分化潛能。

3.2 間充質干細胞的免疫調節性能 除增殖和分化潛能外，研究發現BMSCs表面只表達主要組織相容性復合體（MHC）Ⅰ類分子，不表達或極少表達MHCⅡ類分子以及T細胞活化所需的共刺激分子B7-1、B7-2、CD40和CD40L等［9］，因而具有低免疫原性，可大大減少同種異體的移植排斥反應，在干細胞移植和治療領域是非常理想的干細胞來源［10］。此外，BMSCs還具有一定的免疫調節活性，據報道其可作用于免疫系統的多種細胞，包括樹突狀細胞（dendritic cell，DC）［11］、B細胞［12］、T細胞［13］、自然殺傷（NK）細胞等，并可通過分泌可溶性細胞因子如IL-10、TGF-β1、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）等誘導免疫偏離，因而在免疫系統疾病的治療以及器官移植等領域備受關注。本研究通過將BMSCs與異基因的脾臟T細胞共培養，觀察BMSCs 對T細胞中重要的亞群，包括CD8+的Teffs細胞及CD4+CD25+雙陽性的Tregs細胞的影響，并初步探討其相關機制。結果發現，BMSCs與脾臟T細胞共培養后可明顯降低Teffs細胞的數量并且增加Tregs細胞的比例，這種效應在BMSCs與T細胞直接接觸組中更為顯著，提示細胞與細胞的直接接觸是BMSCs發揮免疫調節功能的一個重要前提。同時，Transwell共培養的方式隔開BMSCs與T細胞時，這種效果仍比較明顯，提示BMSCs可能通過分泌一些可溶性細胞因子參與對T細胞亞群的調節。隨后，筆者用Real-time PCR方法檢測了BMSCs與T細胞共培養后的IL-10和TGF-β1細胞因子的基因表達，證實與T細胞共培養過程中BMSCs的兩種細胞因子水平均得到明顯提高，尤其直接接觸組中最為顯著。上述結果提示BMSCs可能是通過分泌細胞因子和細胞-細胞的直接接觸作用來發揮免疫調節活性。

3.3 前景展望 本實驗獲得了可在體外大量培養擴增的大鼠BMSCs，且具有良好的分化潛能，此外，初步探討了BMSCs的免疫調節性能，發現BMSCs可對異基因的脾臟T細胞一些亞群包括Teffs和Tregs產生影響，可有效降低Teffs細胞比例并且增加Tregs細胞數量，明確了這種影響產生的機制，不僅豐富了BMSCs免疫調節功能的研究，而且為BMSCs在免疫學研究領域的應用提供了進一步的支持。

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（2014-10-08收稿 2014-11-28修回）

（本文編輯 李鵬）

Isolation of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells and explore its role in immunomodulation

ZHANG Zhiqiang，LIU Yi，LI Keqiu，LI Guang△
Department of Biology，Basic Medical College，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China
△Corresponding Author E-mail：lig@tijmu.edu.cn

Objective To explore the immunomodulation property of bone marrow-derived mesenchymal stem cells （BMSCs）from Sprague-Dawley（SD）rats after they are isolated，cultured and identified by surface marker and differentiation potential examination.Methods BMSCs were isolated from femur and tibia of SD rats and passaged by trypsinization.The surface markers of the 3rdpassage BMSCs were detected by flow cytometry and the capacity of their adipocyte and cartilage differentiation were examined.In order to explore the immunomodulation property of BMSCs，allogeneic spleen T cells of Wistar rats were co-cultured with BMSCs through either cell-to-cell contact or transwell，then its effect on the T cell subsets and related mechanism was also examined.Results BMSCs were mainly spindle-shaped in culture.Surface marker detection showed that BMSCs expressed high levels of CD29，CD44 and CD90 but no CD34 nor CD45 at the third generation.Under specific condition，BMSCs could differentiate into adipocytes and chondrocytes.The CD8+effector T cells（Teffs）decreases effectively and the CD4+CD25+regulatory T cells（Tregs）increased remarkably when BMSCs were co-cultured with allogeneic spleen T cells for 48 hours.The expressions of IL-10 and TGF-β1 of BMSCs significantly increased after co-culture with T cells，and this effect was more obvious in cell-to-cell contact group.Conclusion The immunomodulation property of BMSCs were presumably function through cell-to-cell contacts and cytokine secretion.

bone marrow；mesenchymal stem cells；cell differentiation；neuroimmunomodulation；rats，Sprague-Dawley；rats，Wistar

R349.5

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.009

國家高技術研究發展計劃（863計劃）資助項目（2012AA021003）；國家自然科學基金資助項目（21177091）；天津市科技支撐計劃資助項目（12ZCZDSY03400）

天津醫科大學基礎醫學院生物學教研室（郵編300070）

張志強（1988），男，碩士在讀，主要從事免疫耐受方面研究

△E-mail：lig@tijmu.edu.cn