梔翹生肌軟膏無菌檢查方法學探討

田翠　林小暉　鄭鵬（濟南市食品藥品檢驗檢測中心，山東濟南 250001）

梔翹生肌軟膏無菌檢查方法學探討

田翠林小暉鄭鵬
（濟南市食品藥品檢驗檢測中心，山東濟南 250001）

目的：建立梔翹生肌軟膏的無菌檢查方法。方法：按照《中國藥典》2010年版附錄的要求，采用薄膜過濾法進行無菌檢查，沖洗液用量為每筒300ml，通過接種6株陽性菌進行方法學驗證。結果：6株陽性菌在試驗組與陽性對照組均生長良好。結論：本法可消除梔翹生肌軟膏的抑菌作用，適用于該制劑的無菌檢查。

梔翹生肌軟膏 無菌檢查 方法學驗證

梔翹生肌軟膏具有清熱解毒、活血化瘀、去腐生肌的作用，適用于燒傷、燙傷、潰瘍、褥瘡、痔瘡及手足干裂，其對于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有抑菌作用。根據《中國藥典》要求［1］，梔翹生肌軟膏應進行無菌檢查并建立無菌檢查方法驗證。本文按照《中國藥典》要求，采用薄膜過濾法進行無菌檢查方法驗證［2］，建立梔翹生肌軟膏的無菌檢查標準方法。

1　試驗材料與儀器

（1）供試品：梔翹生肌軟膏，批號130526，濟南市衛生科技交流服務中心。

（2）培養基：營養肉湯培養基、改良馬丁培養基、改良馬丁瓊脂培養基、硫乙醇酸鹽流體培養基，pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液，均購自北京三藥科技開發公司； 0.9%無菌氯化鈉溶液按《中國藥典》2010年版附錄中有關規定進行配置、分裝和滅菌。

（3）驗證實驗用菌種（第4代））：大腸埃希菌［CMCC（B）44 102］、金黃色葡萄球菌 ［CMCC（B）26 0003］、枯草芽孢桿菌 ［CMCC（B）63 501］、生孢梭菌 ［CMCC（B）64 941］、白色念珠菌［CMCC（F）98 001］、黑曲霉 ［CMCC（F）98 003］，均購自中國食品藥品檢定研究院。

（4）儀器：高壓蒸汽滅菌器，電子天平，生物安全柜，無菌檢測隔離器，集菌培養器，生化培養箱。

2　方法

（1）菌液的制備：取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、大腸埃希菌的新鮮培養物接種至營養肉湯培養基中，30～35℃培養24小時，取白色念珠菌的新鮮培養物接種至改良馬丁培養基中，23～28℃培養24小時。上述培養物用0.9%的無菌氯化鈉溶液制成小于100cfu/ml的菌懸液，計數，備用；另將黑曲霉孢子懸液用0.9%無菌氯化鈉溶液制成小于100cfu/ml，計數，備用。

表1　無菌檢查方法的驗證結果

（2）供試液制備：取梔翹生肌軟膏10盒，每盒以無菌操作方式稱取1g，加至含20ml無菌十四烷酸異丙酯的容器中，充分振搖使供試品溶解，然后加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液200ml，振搖5～10分鐘，萃取，靜置，使油水明顯分層，取其水層作為供試液。

（3）方法驗證試驗組：取“2.2”項下供試液按薄膜過濾法過濾至集菌培養器中，每個濾筒用300ml pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液分三次沖洗濾膜，沖洗后加相應培養基100ml，然后分別加入小于100cfu/ml的相應菌液至濾筒，硫乙醇酸鹽流體培養基置30～35℃培養，改良馬丁培養基置23～28℃培養，逐日觀察其結果。

（4）方法驗證陽性對照組：不加供試品，直接用pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液，沖洗程序和沖洗量、加培養基、加陽性菌均與“2.3方法驗證試驗組”項下方法相同。與試驗組在相同條件下培養，并逐日觀察其結果。

（5）供試品的無菌檢查：取“2.2”項下供試液按薄膜過濾法過濾至集菌培養器中，每個濾筒用300ml pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液分三次沖洗濾膜，沖洗后加相應培養基100ml，陽性組加入金黃色葡萄球菌作為對照，在相應培養條件下培養，逐日觀察其結果。

（6）陰性對照組：取沖洗液按薄膜過濾法過濾，沖洗后每個濾筒中加入相應培養基100ml，在相應培養條件下培養，逐日觀察其結果。

3　結果與分析

3.1無菌檢查方法的驗證

按照文中驗證的沖洗量和沖洗方法操作，其結果顯示試驗組和陽性對照組培養基均在48h內變渾濁，且2組之間在培養時間方面無顯著差異，表明梔翹生肌軟膏在該條件下無抑菌活性或抑菌活性可以忽略不計。無菌檢查方法驗證情況，見表1。

3.2供試品的無菌檢查

按“3.2無菌檢查方法的驗證”項下的驗證方法，用薄膜過濾法對樣品做無菌檢查發現：陽性對照組培養基在24h內變渾濁，培養14d后，陰性對照組和供試品組均無菌生長，培養基澄清。供試品無菌檢查經培養14d后的情況，見表2。

表2　供試品無菌檢查結果

4　討論

（1）梔翹生肌軟膏處方中含有麻油等脂溶性成分，采用十四烷酸異丙脂作為分散劑，增大它的溶解性，使其充分分散溶解。（2）梔翹生肌軟膏含有抑菌成分，與其他品種燙傷膏類似［3］，故未采用直種法進行方法學驗證，而采用薄膜過濾法，消除供試品中的抑菌成分后再進行無菌檢查。（3）梔翹生肌軟膏系列驗證試驗表明： 樣品試驗組、陽性對照組中各試驗菌均能在 48h 內生長良好。說明在此實驗條件下所采用的該方法適合于梔翹生肌軟膏的無菌檢查。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［S］.中國醫藥科技出版社，2010，附錄XⅢ B：76-79.

［2］中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規范［M］.中國醫藥科技出版社，2010：337-351.

［3］陳引秀，朱錚.復方雪蓮燒傷膏無菌檢查法方法學探討，海峽藥學，2007，19（9）：45-4.