均勻與正交設計法優化水飛薊賓微粒制備工藝的比較研究*

尹雪雁，許涼涼，伊辛，吳晨悅，蔡程科

（北京中醫藥大學中藥學院，北京100102）

均勻與正交設計法優化水飛薊賓微粒制備工藝的比較研究*

尹雪雁，許涼涼，伊辛，吳晨悅，蔡程科

（北京中醫藥大學中藥學院，北京100102）

［目的］通過快速膜乳化耦合溶劑揮發法制備粒徑均一可控的水飛薊賓微粒，對其制備工藝進行考察，優選最佳制備條件，并對均勻設計法和正交設計法進行比較。［方法］以水飛薊賓微粒的平均粒徑D（0.5）及徑距為指標，用均勻設計法和正交設計法對水相濃度、油水相體積比、過膜壓力及固化時間等影響因素進行考察。［結果］確定制備工藝為水相濃度3%、油水相體積比1∶2、過膜壓力0.6 MPa、固化時間60 min。［結論］該制備工藝簡單、快速、穩定、可靠，所得水飛薊賓微粒粒徑均一，均勻設計在水飛薊賓微粒制備工藝篩選實驗中具有很好的可行性。

水飛薊賓；膜乳化耦合溶劑揮發法；微粒；均勻設計；正交設計

水飛薊賓由一分子黃杉素和一分子松柏醇耦合而成，具有清除自由基、抗脂質過氧化、保護肝細胞膜、促進被損傷肝細胞合成DNA和結構蛋白以及抗纖維化等藥理活性［1-2］；同時，兼有抗炎、降血脂、抗腫瘤等新功效［3-4］，對急慢性肝炎、代謝中毒性肝損傷和肝硬化具有較好的療效［5］，是世界上公認的肝損傷修復藥［1］。目前已有相關的藥物上市，如水飛薊賓膠囊、復方益肝靈等藥物［6］。然而，水飛薊賓的水溶性及脂溶性低，口服吸收差，有較大的首過效應，且體內的半衰期短，生物利用度低，不能達到預期的臨床效果，因此，本研究突破常規，采用膜乳化耦合溶劑揮發法制備水飛薊賓微粒，設法增加水飛薊賓的溶解度及溶出度，以提高其生物利用度［7］。實驗中將藥物水飛薊賓溶于有機溶劑中，聚乙烯醇（PVA）水溶液作為抗溶劑，制備水飛薊賓微粒。

本研究以水飛薊賓微粒的平均粒徑D（0.5）和徑距（span）為考察指標，采用新膜材合金加工的0.5微米級的多級串聯膜管，沿用前期的膜乳化耦合溶劑揮發法制備粒徑均一的水飛薊賓微粒，以均勻設計法和正交設計法［8-9］對水飛薊賓微粒的制備工藝進行考察，優選出最佳制備工藝；在前期研究的基礎上，考察更小膜孔徑的膜管及增加膜管級數對微粒粒徑的影響；以目前已普遍認可的正交設計法為對照，對應用均勻設計法的可行性進行分析。

1　儀器與材料

KH-7200DB型數控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司），JFC-1600真空離子濺射儀（日本JEOL公司），JEM-6700F冷場發射掃描電子顯微鏡（日本JEOL公司），馬爾文激光粒徑測試儀（Mastersizer 2000，英國馬爾文儀器有限公司），快速膜乳化器（中國科學院過程工程研究所），不銹鋼膜乳化裝置（北京中醫藥大學）。

水飛薊賓（西安華萃生物技術有限責任公司，批號20111101，純度＞99%），聚乙烯醇PVA1788（山西三維集團股份有限公司），去離子水（北京中醫藥大學），氯化鈉（北京市化工廠），乙酸乙酯等。

2　水飛薊賓微粒制備工藝研究

2.1樣品制備前期處理在水飛薊賓微粒的制備前，需經過含藥油相、水相的制備等前期處理，以油相濃度0.8%，水相濃度3%，油水相體積比1∶9，制備100 mL預乳液［10］為例制備樣品。

制備水相：精密稱量3 g聚乙烯醇（PVA1788），邊攪拌邊加入100 mL常溫去離子水，IKA磁力攪拌器進行攪拌（轉速檔×4，溫度檔×3），攪拌30 min至無明顯顆粒，60℃水浴鍋保溫，真空抽濾，過膜，待用。

制備含藥油相：精密稱取水飛薊賓0.8 g于具塞錐形瓶中，加入100 mL乙酸乙酯［11］有機溶劑，加塞封口，放入60℃水浴鍋中溶解至透明澄清，無明顯顆粒，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，待用。

2.2快速膜乳化耦合溶劑揮發法制備水飛薊賓微粒精密稱取10 mL含藥油相，分散于90 mL水相中，不加成球輔料聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA），振蕩至均勻混懸，倒入快速膜乳化器［12］中，經氮氣加壓，從出液口收集濾液，過膜3次，加入1倍量3%PVA溶液作固化液，磁力攪拌，固化1.5h，離心清洗4次（PVA基本被清除），生理鹽水復溶后，收集沉淀物，冷凍干燥制成凍干粉。

2.3評價指標

2.3.1微粒的粒徑將一定量的凍干微粒在一定量的生理鹽水中分散，采用馬爾文激光粒徑測試儀測定粒徑分布。本實驗采用平均粒徑D（0.5）值為評價指標之一，D（0.5）越小粒徑越小［13-14］。

③對試驗路段進行試鋪，確定攤鋪機的攤鋪速度、攤鋪寬度、攤鋪溫度、自動找平方式等攤鋪步驟；壓路機碾壓溫度、碾壓速度、碾壓次數等壓實步驟以及松鋪系數。

2.3.2微粒的徑距同樣使用馬爾文粒徑測試儀可以檢測出微粒的徑距（span）。徑距代表微粒粒徑的跨越范圍，span值越小說明微粒分布越均一。平均粒徑及徑距可由下圖1得出。

圖1　水飛薊賓微粒粒徑分布圖Fig.1　The distribution diagram of silybin particles size

2.3.3微粒的電鏡特征導電膠布粘在樣品臺上，取少量水飛薊賓微粒均勻平鋪于導電膠布上，并用吸耳球吹走多余粉末，抽真空，采用離子濺射儀對樣品噴金（20 mA，120 s）后，將樣品臺置于掃描電鏡樣品室中，抽真空，觀察微粒形貌［13-14］。圖2中（1）和（2）分別為微粒放大5 000倍和10 000倍下微粒的電鏡圖。

圖2　水飛薊賓微粒掃描電鏡圖Fig.2　The scanning electron microscope figure of silybin particles

3　水飛薊賓微粒常規制備的工藝參數

快速膜乳化耦合溶劑揮發法制備水飛薊賓微粒的步驟主要包括預乳液的制備、乳液加壓過膜、溶劑揮發、固化清洗、微粒收集、冷凍干燥等環節，整個制備過程中存在很多影響微粒表征的因素。前期課題組已對實驗過程中膜管孔徑大小、油相濃度、水相濃度、油水相體積比、過膜壓力、預乳液與固化PVA溶液體積比［15-17］，以D（0.5）、span為指標進行了初步考察。常規因素水平：水相濃度、油相濃度、油水相體積比、固化液種類、過膜壓力、膜孔徑等，詳細說明見表1。

表1　常規因素水平表Tab.1　Factors of the conventional level table

4　均勻設計法及正交設計法優化水飛薊賓微粒制備工藝的比較

4.1均勻設計實驗結合課題組前期單因素考察結果，篩選出對微粒制備影響較大的因素，通過均勻設計實驗進行工藝優化。以D（0.5）及span綜合的校正參數作為評價指標，校正參數愈小，結果愈好。根據U9（95）（D=0.406 6）的均勻設計使用表，將水相濃度、油水比、過膜壓力、固化時間分別安排在表的1、2、3、5列（D=0.406 6），均勻設計實驗水相濃度、油水相體積比、過膜壓力及固化時間各因素水平詳見表2，均勻設計實驗方案安排及結果詳見表3（n=2）。

均勻設計實驗相關性由SPSS17.0分析所得，分析結果詳見表4。

表2　因素水平表Tab.2　Factor level table

表3　均勻實驗設計方案與結果Tab.3　Scheme and results of uniform design

表4　均勻設計相關系數分析結果（n=18）Tab.4　Analysis results of correlation coefficient（n=18）

由表4 SPSS17.0相關性分析結果可知，校正參數與油水比、過膜壓力兩因素的顯著性系數（P值）分別為0.020、0.000，兩者均小于0.05，說明校正參數與油水比、過膜壓力兩因素相關；油水比、過膜壓力兩因素的Spearman相關系數的絕對值分別為0.489、0.867，說明過膜壓力與校正參數的相關性較好，且油水比、過膜壓力兩因素與校正參數均呈負相關。綜上，均勻設計工藝優化的結果是油水比2∶3，壓力0.75 MPa。

4.2正交設計實驗同4.1均勻實驗設計考察因素一致，通過正交設計實驗進行工藝優化。以D（0.5）及span兩者綜合的校正參數作為評價指標，校正參數數值愈小愈好。根據L9（34）的正交表，將上述四因素分別安排在表的1、2、3、4列，正交設計實驗因素水平安排詳見表5，正交設計實驗方案及結果詳見表6（n=2）。

4.2.1結果分析

表5　因素水平表Tab.5　Factor level table

表6　正交設計表Tab.6　Orthogonal design table

表7　正交實驗直觀分析結果Tab.7　The results of orthogonal design-direct analysis

通過直觀分析可得出影響微粒的因素由大到小為：過膜壓力（C）＞水相濃度（A）＞油水比（B）＞固化時間（D），最佳實驗條件參數為C2A0B2D2。

4.2.1.2方差及相關性分析根據表6正交實驗設計與結果中數據進行方差分析，具體結果詳見表8。

由表8方差分析結果知，因素A、B、C、D的P值均小于0.05，均有統計學意義，說明因素A、B、C、D對微粒的表征均有影響。結合表9相關性分析結果可知，因素A、C的P值分別為0.021、0.001，兩者均小于0.05，均有統計學意義，說明因素A、C相對地與微粒表征的相關性較大；因素A、C的Spearman相關系數的絕對值分別為0.485、0.682，說明因素C較因素A與微粒的相關性較大，最佳實驗條件參數為C2A0。結合實際條件，由表10過膜壓力與固化時間均值表可知，因素C在1、2水平C1、C2時均值相當，為節省氮氣資源，優先考慮使用過膜壓力0.6MPa；因素D在0、2水平C0、C2時均值相當，為提高制備效率，優先考慮使用固化時間60 min，綜上，正交設計實驗的最佳工藝參數條件為C1A0B2D0，即水相濃度為3%，油水比為1∶2，過膜壓力為0.6 MPa，固化時間為60 min。

表8　正交實驗方差分析結果Tab.8　The results of analysis of variance

表9　正交設計相關系數分析結果（n=18）Tab.9　Analysis results of correlation coefficient（n=18）

表10　過膜壓力與固化時間均值Tab.1　0Mean of pressure through membrane and curing time

5　討論

快速膜乳化耦合溶劑揮發法制備水飛薊賓微粒的基本原理是把研究藥物溶解于有機溶劑中形成溶液，選擇另一種不能溶解藥物及有機溶劑的溶液作為抗溶劑，通過超聲或振蕩等方法將有機溶劑擴散到抗溶劑中，形成乳液，乳液經加壓通過多孔過濾膜管，有機溶劑被擠壓成微小液滴，分散在抗溶劑中，隨著有機溶劑的揮發，藥物微粒析出并懸浮于抗溶劑中，離心洗滌，收集微粒，即得水飛薊賓微粒。快速膜乳化法制備工藝簡單、無需加熱、成本低，制得的微粒粒徑較小且均勻，本實驗為水飛薊賓的合理研究開發和有效利用提供了新的研究思路，提升了水飛薊賓的應用價值。

由課題組前期的單因素實驗考察結果可知，隨著過膜壓力增加，微粒D（0.5）及span呈減小的趨勢。均勻設計結果也表明，過膜壓力最大值0.75 MPa為優化條件，與單因素考察結果相符。分析過膜壓力對微粒的影響受液滴黏度、液滴表面張力、膜管孔徑大小及堵塞程度等眾多因素影響。均勻設計中膜管清洗充分，乳液用量較少，但多級小孔徑新膜管的串聯使乳液過膜的分級壓力逐級遞減，較大的外界壓力才能使乳液順暢流出。將均勻設計實驗與正交設計實驗的結果進行分析比較后可知：在理論最佳制備條件方面，對過膜壓力和油水相體積比的結論是一致的，但考慮到實際制備條件，并且為了節省氮氣資源，提高制備效率，對于新合金多級膜管的水飛薊賓微粒的制備，優選過膜壓力0.6 MPa，油水相體積比1:2，水相濃度3%，固化時間60 min。

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（本文編輯：高杉，馬英）

Comparative study on optimization of silybin particles preparation by uniform design and orthogonal design

YIN Xue-yan，XV Liang-liang，YI Xin，WU Chen-yue，CAI Cheng-ke
（School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

［Objective］To prepare silybin micro-particles by premix membrane emulsification coupling solvent evaporation，investigate its preparation procedure，optimize the preparation conditions by the uniform design and orthogonal design，respectively，and compare the two experiment design methods in terms of their feasibility.［Methods］With the average diameter of particle D（0.5）and span as criteria，the uniform design and orthogonal design were used，respectively，to examine the influence of such factors，as the aqueous phase concentration，volume ratio of oil phase to water，pressure through membrane and curing time，on the preparation procedure.［Results］It was found that the optimized preparation procedure was the aqueous phase concentration 3%，volume ratio of oil phase to water 1:2，pressure through membrane 0.6 MPa and the curing time for 60 min.［Conclusion］The preparation procedure is simple，fast，stable and reliable. The average diameter of particle of the silybin micro-particles is uniform.The uniform design shows a higher feasibility in the present screening test on the preparation procedure of the silybin micro-particles.

silybin；premix membrane emulsification coupling solvent evaporation；micro-particle；uniform design；orthogonal design

R283

A

1672-1519（2015）12-0752-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.12.13

國家自然科學基金資助項目（81173562）。

尹雪雁（1989-），女，碩士在讀，從事中藥新劑型與新制劑研究。

蔡程科，E-mail:cck98@126.com。

（2015-06-29）