響應面法優化川黨參多糖的提取工藝研究*

武新亮，王宏軍，白子霞，龍元桃（.天津市寶坻區人民醫院藥劑科，天津30800；.遼寧醫學院，錦州00）

響應面法優化川黨參多糖的提取工藝研究*

武新亮1，王宏軍2，白子霞1，龍元桃2
（1.天津市寶坻區人民醫院藥劑科，天津301800；2.遼寧醫學院，錦州121001）

［目的］采用響應面法（RSM）優化川黨參中多糖的提取工藝。［方法］在單因素實驗基礎上，以提取溫度、提取次數、提取時間3個因素為自變量，多糖提取率為響應值，采用三因素三水平的響應面分析各因素對響應值的影響。［結果］多糖的最佳工藝條件為提取溫度80℃，提取次數5次，提取時間5 h，多糖實際提取率可達22.31%。［結論］應用響應面法優選出的提取工藝穩定、合理、可行。

川黨參；多糖；響應面法；提取工藝

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.07.13

川黨參為桔梗科植物川黨參（Codonopsis tangshen Oliv.）的干燥根，主產于四川、貴州、湖南等地，為中藥黨參的來源之一，具有補中益氣，生津，養血等功效，主要用于治療脾胃虛弱，氣血兩虧，體倦無力等［1］，可與多種藥物配伍使用治療女子癥瘕［2］、眩暈［3］、充血性心力衰竭［4］等疾病。現代研究表明，其中主要含有多糖、酚類、甾醇、揮發油及生物堿等多種成分［5］，其中多糖具有明顯的免疫促進功能［6］，清除氧自由基［7］，抗腫瘤［8］，降血糖［9］等多種活性。

響應面法（RSM）是采用多元二次回歸方法作為函數估計的方法，將多因子實驗中因子與指標的相互關系用多項式擬合，依此可對函數的響應面和等值線進行分析，研究因子與響應面之間、因子與因子之間的相互關系［10］。與以往采用的正交設計法不同，在實驗設計與表述結果方面更加優良，目前已廣泛應用到提取工藝的優化中［11-14］，因此，選用響應面法優化川黨參中多糖的提取工藝，為川黨參多糖的進一步研究提供理論基礎。

1　材料與儀器

1.1材料川黨參采自于四川成都，經沈陽藥科大學李玉山教授鑒定為川黨參（Codonopsis tangshen Oliv.）的根。無水乙醇、氯仿、葡萄糖、蒽酮、硫酸、甲醇均為國產分析純。

1.2儀器KDM型可調控溫電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器有限公司），UV757CRT型紫外可見分光

光度計（上海精密科學儀器有限公司），DZKW-4型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司），RE-5203型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），FA2004N型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）。

2　方法

2.1多糖的提取川黨參干燥，粉碎，過60目篩。稱取粉末50g，加入氯仿甲醇、80%乙醇依次進行處理后，殘渣干燥，精確稱質量，每份1g，蒸餾水煎煮提取。濾液濃縮加無水乙醇使醇濃度達到80%，冷藏，靜置，過濾，濾液殘渣烘干，溶解，定容［15-16］。

2.2蒽酮—硫酸溶液的制備［17］精密稱取蒽酮0.33g，溶于100 mL濃硫酸中，置棕色試劑瓶中備用。

2.3標準溶液的制備及測定精密稱取葡萄糖100mg，加蒸餾水溶解定容至100mL，再稀釋至0.05g/L。精密吸取標準品0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL分置10mL具塞試管中，加蒸餾水補足至1mL，加入蒽酮—硫酸溶液2mL，冰浴中冷卻，再置水浴鍋中加熱10min，冷卻，于625 nm處測定吸光度，繪制標準曲線，以吸光度（Ai）對樣品濃度（Ci）作回歸分析，得到回歸方程，Ai=18.433 9 Ci-0.014 5，r=0.999 8，糖含量在0～0.05g/L范圍內具有良好的線性關系。

2.4多糖含量與提取率的測定取待測品，溶于5mL蒸餾水中，稀釋1 000倍，分別精密吸取0.4、0.8mL置10mL具塞試管中，加蒸餾水補足至1mL，按標準溶液的方法進行測定，多糖提取率公式如下。

2.5單因素實驗以多糖提取率為指標，分別選取提取溫度、料液比、提取次數、提取時間為考察因素［18］，進行單因素實驗。

2.6響應面實驗設計在單因素實驗基礎上，根據中心組合實驗設計（Box-Benhnken）原理，利用Design-Expert 7.13軟件進行響應面的擬合與分析。選取提取溫度（A）、提取次數（B）、提取時間（C）3個因素，采用三因素三水平的響應面法進行實驗設計。

表1　中心組合實驗設計因素水平表Tab.1 Box-Benhnden factorsand levels

3　結果與討論

3.1單因素實驗

3.1.1提取溫度對多糖提取率的影響在85℃以前，隨著提取溫度的升高，多糖提取率呈現上升趨勢，且變化較為顯著，由于溫度的升高可以加速分子熱運動，導致多糖的提取率上升；在85℃以后，隨著提取溫度的增高稍有下降，這可能是隨著溫度的進一步升高多糖結構被破壞的緣故。由此可選擇提取溫度80～90℃較為適宜。見圖1。

圖1　提取溫度對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extracting tem perature on the yield of polysaccharide

3.1.2料液比對多糖提取率的影響根據結果繪制曲線，隨著比例的逐漸增大，多糖提取率逐漸上升，料液比的增大可以使分子有足夠的熱運動空間，從而促進多糖充分的溶解釋放。但增大到一定程度后，多糖的提取率變化很小，因此料液比選擇為1∶25。見圖2。

圖2　料液比對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of solid/solvent ratio on the yield of polysaccharide

3.1.3提取次數對多糖提取率的影響由于足夠的提取次數，每次加入的溶劑可以為多糖分子提供了較大的濃度梯度，有利于多糖分子的擴散，提取率逐漸增加，但增加到一定的次數的時候，提取率基本不再變化，確定提取次數4～6次為宜。見圖3。

圖3　提取次數對提取率的影響Fig.3 Effectof extracting timeson the yield of polysaccharide

3.1.4提取時間對多糖提取率的影響隨著提取時間的增加，多糖分子具有充足的時間在溶劑中溶解擴散，從而使多糖提取率顯著增加，但增大到一定時間以后多糖提取率幾乎保持不變。考慮提取成本和費時的原因，所以提取時間選擇4～6 h間為宜。見圖4。

圖4　提取時間對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extracting time on the yield of polysaccharide

3.2響應面實驗

3.2.1實驗結果與模型的建立提取溫度（A）、提取次數（B）、提取時間（C）的優化實驗結果見表2。共15個實驗點，其中12個為析因點，3個為零點，析因點為自變量取值A、B、C所構成的三維頂點，零點為區域的中心點。其中零點實驗重復3次，用以估算實驗誤差。利用Design-Expert7.13軟件對響應值與各因素進行回歸擬合，對實驗數據進行多元回歸擬合，得到的二次多項回歸模型為：Y=24.766 7+ 0.456 3A+0.673 8B+0.635C-0.13A B-0.342 5AC-0.032 5BC-0.628 3A2-1.188 3B2-1.560 8C2。

表2　響應面實驗設計及數據結果Tab.2 RSM experimental design and response value of the extraction technology

3.2.2回歸分析利用Design-Expert7.1.3軟件分析功能對回歸模型和回歸模型系數分別進行顯著性分析，結果見表3、表4。

表3　回歸模型的方差分析Tab.3 Analysisofvariance to the regressionmodel

從表3可知，整體模型的P值為0.0411（P＜0.05），表明該二次方程模型顯著；模型的失擬項的P值為0.206 4（P＞0.05），說明模型選擇適宜；并且該模型總回歸系數R2=0.9045，說明該模型與實際試驗擬合較好，可以用于川黨參多糖提取實驗的理論預測。

表4　回歸模型系數的方差分析Tab.4 Analysisof variance to themodelcoefficients

由表4方差分析結果可知，該模型的一次項提取次數（B）和提取時間（C）對多糖提取率有顯著影響（P＜0.05），其余不顯著；二次項提取時間（C）達到高度顯著水平（P＜0.01），提取次數（B）具有顯著影響（P＜0.05），表明各個影響因素與響應值不是線性關系。

3.2.3因素間交互影響分析為了進一步研究相關變量之間的交互作用，利用響應面圖與等高線圖來進行可視化的分析，等高線圖上的值與響應面上的點一一對應，可以清晰的反映提取溫度、提取次數、提取時間對多糖提取率的影響。各因素處于不同實驗水平時，對響應值的影響呈現出不同的變化規律，響應曲面呈現不同程度的扭曲。圖5-7顯示，各響應面扭曲程度很小，等高線圖形近似于圓形，各交互作用均不顯著，這與回歸分析的結果一致（P值分別為0.724 4、0.370 8和0.929 3）。綜合各響應面分析發現，各因素對響應值作用的顯著性由高到低為B＞C＞A（P值分別為0.0411、0.0496和0.1233）。

3.2.4最佳提取工藝條件的確定結合數據模型分析得到提取溫度80℃，提取次數為4.62次，提取時間4.87 h，但考慮到實際操作的便利，將最佳提取條件工藝修正為提取溫度80℃，提取次數5次，提取時間5 h，在此修正條件下，進行平行實驗，實際測得一次提取率為22.31%，回歸模型預測提取率理論值可達22.84%，實際測定值比理論預測值低0.53%。因此回歸方程能較好地預測理論提取率。

圖5　提取溫度與提取次數對多糖提取率影響的響應面圖Fig.5 Responsesurfacegraph showing theeffectof extracting temperatureand extracting timeson the yield ofpolysaccharide

圖6　提取溫度與提取時間對多糖提取率影響的響應面圖Fig.6 Response su rfacegraph show ing the effect of extracting tem perature and extracting tim e on the yield of polysaccharide

圖7　提取時間與提取次數對多糖得率影響的響應面圖Fig.7 Response su rfacegraph show ing the effect of extracting tim e and extracting timeson the yield of polysaccharide

4　結論

本次實驗通過單因素實驗考察了工藝因素對川黨參中多糖提取率的影響，發現提取溫度、提取次數、提取時間對多糖提取過程影響最為顯著。通過響應面法建立關鍵因素對多糖提取率的二次多項數學關系模型［19］，并利用統計學方法對該模型進行了顯著性檢驗，優化了工藝因素，探討了個因素間的交互作用。利用軟件分析結合實際情況得知提取溫度為80℃，提取次數為5次，提取時間為5 h時多糖提取率最高，實際測得提取率為22.31%，回歸模型預測提取率理論值可達22.84%。實際測定值比理論預測值低0.53%。因此回歸方程能較好地預測理論提取率。本實驗優選出的提取條件，對今后川黨參中多糖的進一步提取研究具有一定的指導作用。

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（本文編輯：高杉，滕曉東）

Op tim ization of theextraction techniqueof Codonopsis tangshen Dliv.polysaccharideusing response surfacemethodoloy

WU Xin-liang1，WANGHong-jun2，BAIZi-xia1，LONGYuan-tao2
（1.Departmentof Pharmacy，Tianjin BaodiHospital，Tianjin 301800，China；2，LiaoningMedicalUniversity，Jinzhou 121001，China）

［Objective］To optimize the extraction conditions of polysaccharide in Codonopsis tangshen Oliv.using response surface methodology（RSM）.［M ethods］On thebasisofsingle factor test，extracting temperature，extracting timesand extracting timewere selected as response factors；the yield of polysaccharide wasused as response value.A three-factor-three-levelexperimentdesign was developed.RSM wasemployed to analyze the resultsof experiments.［Results］The optimum extraction conditionsofpolysaccharidewere as follows:extracting temperature was 80℃，extracting times was 5 times，and extracting time was 5 h.The yield of polysaccharide was 22.31%.［Conclusion］RSM employed in optimization of theextraction conditions is feasible.

Codonopsis tangshen Oliv.；polysaccharide；RSM；extraction technique

R284.2

A

1672-1519（2015）07-0432-05

國家自然科學基金項目（31201951）；遼寧省優秀人才項目（LJQ2013087）。

武新亮（1980-），男，碩士，主要研究方向為中藥有效成分研究。

王宏軍，E-mail：lnwhj2012@163.com。

（2015-02-03）