亳州產丹參藥材UPLC-MS指紋圖譜研究*

王　洋，石　喆，陳　濤，李　正，崔維利，李　進（天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津300193）

亳州產丹參藥材UPLC-MS指紋圖譜研究*

王洋，石喆，陳濤，李正，崔維利，李進
（天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津300193）

［目的］研究和建立亳州產丹參藥材的超高效液相色譜-質譜聯用技術（U PL C-M S）指紋圖譜，考察不同批次丹參藥材的質量穩定性，為全面的評價其整體質量提供依據。［方法］采用U PL C-M S法分別對水溶性成分和脂溶性成分進行測定，對10批樣品的相似度進行計算分析；對共有峰進行標定，并通過M S數據對色譜峰進行指認。［結果］建立了10批亳州產丹參藥材中水溶性成分和脂溶性成分的U PL C-M S指紋圖譜，標定共有峰18個，其中水溶性成分8個，脂溶性成分10個，鑒定了其中9個色譜峰的化學成分，10批樣品的相似度均大于0.90。［結論］該方法準確可靠、重現性好，可以用于丹參藥材的整體質量評價。

丹參藥材；液質聯用；指紋圖譜；質量控制

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.07.14

丹參為唇形科植物丹參（Salviamiltiorrhiza Bge.）的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消痛的功效［1］。丹參中主要包括水溶性的丹參酚酸類和脂溶性的丹參酮類成分［2］。現代研究表明，丹參具有多種藥理作用，特別是在治療心腦血管疾病時［3-7］，其時常作為原料藥單一使用或與其他藥物配伍組成復方使用［8-13］。丹芪偏癱膠囊為國家中藥6類新藥，由丹參、黃芪、赤芍等14味藥物組成，主要用于腦梗死的恢復期［14-15］，丹參為其中君藥，主要有效成分既有酚酸類成分，又包括脂溶性的丹參酮類成分。

丹芪偏癱膠囊中丹參的產地已固定為安徽亳州，目前丹參藥材的企業質量控制方法為2010版《中國藥典》，采用高效液相色譜（HPLC）法對藥材中丹酚酸B和丹參酮IIA進行含量測定。而中藥作為復雜混合體系，其成分組成復雜，僅以其中的某幾個成分為指標很難全面的表征其化學特征和控制整體質量。指紋圖譜技術可以對中藥中的化學成分進行全方位的表征，這正好與中醫強調的整體觀念相吻合［16］。本研究采用快速、高效且定性準確的超高效液相色譜-質譜聯用技術（UPLC-MS），建立了10批安徽亳州產丹參藥材的指紋圖譜，對丹參中水溶性及脂溶性成分進行了全面分析，通過標準品對其中主要的指紋峰進行了指認，并通過相似度計算對樣品進行了評價，為制定丹芪偏癱膠囊中丹參藥材的全面質量控制方法提供了科學依據。

1　儀器與試藥

Acquity UPLC I-class超高效液相色譜儀、XEVOTQD三重四極桿串聯質譜儀、電噴霧離子化源（ESI）、MassLynx數據處理系統（美國Waters公司）；AG135電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ300DE數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

對照品丹酚酸B（批號111562-200504）、丹參素鈉（批號110855-200809）、隱丹參酮（批號852-9903）、丹參酮Ⅰ（批號0867-200104）、丹參酮ⅡA（批號110766-200417）、迷迭香酸（批號111871-201001）購自中國藥品生物制品檢定所；紫草酸（批號20131203）購自上海永恒生物科技有限公司；丹酚酸A（批號MUST-13020701）、二氫丹參酮Ⅰ（批號MUST-13082317）購自成都曼思特生物科技有限公司；上述標準品的結構式如圖1所示。試劑甲醇（德國Merck公司）、甲酸（美國Tedia公司）均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為自制超純水。丹參藥材由天津市石天藥業有限責任公司提供（均采自安徽省亳州市），由天津中醫藥大學第一附屬醫院李進主任藥師鑒定，為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖。丹參藥材的具體產地見表1。

圖1　 9種丹參成分的結構式Fig.1 Structuresofnine chem ical constituents in Danshen

表1　安徽亳州不同地區產丹參藥材Tab.1 Danshens’origin in AnhuiBozhou from different habitats

2　方法與結果

2.1色譜條件色譜柱：ACQUITYUPLC?HSST3（2.1mm×100mm，1.7μm）。流動相：0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫，脂溶性成分：0～2min，25%～30%B；2～3min，30%～50%B；3～5 min，50%～60%B；5～10min，60%～70%B；10～15min，70%～80% B；15～16min，80%～25%B；16～18min，25%B；水溶性成份：0～3min，10%～19%B；3～7min，19%～23%B；7～9min，23%～30%B；9～11min，30%B；11～12min，30%～10%B；12～15min，10%B。流速：0.4mL/min；樣品室溫度：20℃；進樣體積：5μL；柱溫：水溶性成分30℃，脂溶性成分40℃。

2.2質譜條件電離源：ESI，水溶性成分負離子掃描，脂溶性成分正離子掃描。脫溶劑溫度：400℃，脫溶劑氣體流量：700 L/h，錐孔電壓：50 V，錐孔氣流量：50 L/h，毛細管電壓：3 kV，離子源溫度：150℃，質量掃描范圍：m/z100～1000。

2.3溶液制備

2.3.1對照品溶液的制備分別取丹酚酸B、丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸A適量，精密稱定，加50%甲醇分別制成約100μg/mL的對照品溶液；分別取二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA適量，精密稱定，加甲醇分別制成約100μg/mL的對照品溶液，即得。

2.3.2供試品溶液的制備取丹參藥材，粉碎，過2號篩，精密稱定1.0g，置具塞三角瓶中，加入甲醇50mL，超聲40min，過濾，蒸干，用甲醇溶解殘渣并轉移至50mL量瓶中，加甲醇稀釋至50mL，過濾，取續濾液，即得脂溶性成分供試品溶液。取甲醇超聲濾過后的藥粉殘渣，加入50%甲醇50mL，超聲40min，過濾，蒸干，用50%甲醇溶解殘渣并轉移至50mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至50mL，過濾，取續濾液，即得水溶性成分供試品溶液。

2.4指紋圖譜方法學考察

2.4.1精密度實驗取樣品S1 1份，按“2.3.2”項下

方法制備丹參水溶性及脂溶性成分供試品溶液，精密量取同一供試品溶液，連續進樣6次，考察儀器的精密度。結果表明，色譜峰的相對保留時間的RSD均小于1.0%，峰面積的RSD均小于3.0%，說明儀器精密度良好。

2.4.2重復性實驗取樣品S1 6份，按“2.3.2”項下方法平行制備丹參水溶性及脂溶性成分供試品溶液各6份，考察方法的重復性。結果表明，色譜峰的相對保留時間的RSD均小于2.0%，峰面積的RSD均小于3.0%，表明方法重復性良好。

2.4.3穩定性實驗取樣品S1 1份，按“2.3.2”項下方法制備丹參水溶性及脂溶性成分供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24 h進樣檢測，考察供試品溶液的穩定性。結果表明，色譜峰的相對保留時間的RSD均小于1.5%，峰面積的RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內基本穩定［17-19］。

2.5指紋圖譜的建立與共有峰的確定按“2.3.2”項下方法制備10批次的丹參水溶性及脂溶性成分供試品溶液，按“2.1”項色譜條件及“2.2”項質譜條件進行檢測，建立丹參藥材中水溶性成分及脂溶性成分的UPLC-MS總離子流色譜指紋圖譜，如圖2所示。將上述10批次藥材的結果導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2004A版），對亳州產丹參藥材的水溶性成分及脂溶性成分的UPLC-MS總離子流色譜圖譜進行匹配。標定匹配數目為10的色譜峰為共有峰，其中水溶性成分8個，脂溶性成分10個，且共有峰的總面積占總峰面積的90%以上。2.6指紋圖譜相似度計算采用國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2004A版）進行相似度計算，結果見表2和表3。10批丹參藥材的水溶性成分和脂溶性成分的相似度結果均大于0.90。說明10個批次丹參藥材的化學輪廓比較接近，成分比較穩定。

表2　 10批藥材水溶性成分指紋圖譜相似度Tab.2 Fingerprrint sim ilarity ofphenolic acids inn 10 batch herbs

圖2　典型的丹參藥材UPLC-MS總離子流色譜指紋圖譜（S1）Fig.2 TypicalUPLC-MS total ionic chromatographic fingerp rintsof Danshen（S1）

表3　 10批藥材脂溶性成分指紋圖譜相似度Tab.3 Fingerprrint sim ilarity of tanshinones in 10 batchesherbs

2.7指紋圖譜色譜峰的確認采用對照品對指紋圖譜中的色譜峰進行確認。按“2.1”項色譜條件及“2.2”項質譜條件，分別進樣供試品溶液、對照品溶液，通過保留時間和質譜信息，確認色譜峰，結果見圖2。

3　討論

本研究通過采用UPLC-MS技術建立了安徽亳州產丹參藥材的總離子流色譜指紋圖譜。通過連續提取制備供試品溶液，主要考慮與丹芪偏癱膠囊的制備工藝保持一致，以便能最大限度的反應藥材的化學指紋特性。選擇質譜作為樣品測定的檢測器，可以有效地克服紫外檢測器的局限性以及蒸發光散射檢測器的不穩定性，并且其具有更加準確的定性能力。在色譜條件的建立時考察了BEH及HSS T3兩種型號的色譜柱，結果表明對于極性較大的丹參水溶性成分，HSST3具有更好的保留特點和更多的色譜峰數目。在流動相的選擇上，分別考察了甲醇、乙腈、甲酸、乙酸等溶液的組合，兼顧考慮分離及化合物的電離效果，確定以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈溶液系統梯度洗脫效果最佳。質譜條件的優化主要是考慮主要化合物的響應情況，由于酚酸類化合物易產生［M-H］-離子，而丹參酮類化合物易產生［M+H］+離子，所以選擇負離子模式對水溶性成分進行掃描，選擇正離子模式對脂溶性成分進行掃描。通過文獻檢索發現，質量掃描范圍為m/z100～1 000可以有效地滿足丹參藥材中小分子有機化合物的分析要求。在此基礎上，再通過優化毛細管電壓、錐孔電壓等質譜工作參數，使供試品獲得最大的離子響應。

中藥指紋圖譜可以全面的反應其整體化學信息，避免單一組分的局限性。本研究建立了丹芪偏癱膠囊中君藥丹參中水溶性及脂溶性成分的UPLC-MS總離子流色譜指紋圖譜，共計標定共有峰18個，明確了其中9個色譜峰的成分。該方法準確可靠、重現性好，可以有效地控制丹參藥材的整體質量。為從源頭上保證丹芪偏癱膠囊質量的穩定性提供了實驗依據。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部［S］.北京：化學工業出版社，2010.

［2］Li YG，Song L，Liu M，et al.Advancement in analysis of Salviae miltiorrhizaeRadixetRhizoma（Danshen）［J］.JChromatogr A，2009，1216（11）:1941-1953.

［3］Cheng TO.Danshen:whatevery cardiologistshould know about this Chineseherbal drug［J］.Int JCardiol，2006，110（3）:411-412.

［4］王怡，高秀梅，邢永發，等.丹參酚酸B、丹參酮治療心血管疾病的藥理學研究進展［J］.上海中醫藥雜志，2010，44（7）:82-87.

［5］楊征，邱敏，等.丹參酮ⅡA的心血管作用及機制研究進展［J］.中國動脈硬化雜志，2011，19（4）:372-374.

［6］劉士林.丹參酮保護心血管疾病的作用機制進展［J］.中國醫藥科學，2015，5（4）:32-34.

［7］焦克勝.丹參抗心血管疾病有效成分的虛擬篩選研究［D］.鄭州:鄭州大學，2013:5.

［8］劉梅，夏鑫華，侴桂新，等.丹參藥材超高效液相色譜指紋圖譜研究［J］.廣州中醫藥大學學報，2009，26（6）:559-564.

［9］管敏國，張宇燕，萬海同，等.丹參川芎有效成分配伍對缺氧損傷大鼠腦內皮細胞的影響［J］.安徽中醫藥大學學報，2014，33（2）:74-78.

［10］黃文東，楊永飛，陳建文，等.丹參素與川芎嗪對心血管系統的協同作用［J］.中國藥理學通報，2013，29（3）:432-436.

［11］顧健，李佳川，譚睿，等.葛根-丹參組方配伍對動脈粥樣硬化鵪鶉脂質代謝的影響［J］.中國中藥雜志，2013，38（22）:3939-3942.

［12］高紅莉，王德才，曲曉蘭，等.黃芪丹參配伍對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織VEGF和bFGFm R NA表達的影響［J］.中藥藥理與臨床，2013，29（5）:95-98.

［13］何增芬.烏腺金絲桃與丹參抗實驗性快速心律失常的配伍研究［D］.哈爾濱：黑龍江中醫藥大學，2014.

［14］Chen C，Venketasubramanian N，Gan R N，et al.Danqi Piantang Jiaonang（DJ），a traditionalChinesemedicine，inpoststroke recovery［J］. Stroke，2009，40（3）:859-863.

［15］Quintard H，Borsotto M，Veyssiere J，etal.MLC901，a traditional Chinese medicine protects the brain againstglobal ischemia［J］. Neuropharmacology，2011，61（4）:622-631.

［16］羅國安，梁瓊麟，王義明，等.中藥指紋圖譜-質量評價、質量控制與新藥研發［M］.北京:化學工業出版社，2009.

［17］羅國安，梁瓊麟，王義明，等.中藥材和飲片的高效液相色譜指紋圖譜鑒別［J］.世界科學技術—中醫藥現代化，2004，6（5）:11-16.

［18］屠鵬飛.中藥材指紋圖譜的建立及技術要求實例解說［J］.中國藥品標準，2000，1（4）:22-29.

［19］李耿，孟繁蘊，楊洪軍，等.UPLC法同時測定丹參中11種成分的含量［J］.中國藥房，2014，25（19）:1766-1768.

（本文編輯：高杉，滕曉東）

UPLC-M S fingerprint of Salviam iltiorrhiza Bge.in Bozhou

WANGYang，SHIZhe，CHEN Tao，LIZheng，CUIWei-li，LIJin
（The FirstA ffiliated Hospitalof Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To study and establish the UPLC-MS fingerprintof Salviamiltiorrhiza Bge.（Danshen），to investigate the stability of differentbatchesof sample for comprehensive evaluation of the quality of Danshen.［M ethods］The fingerprintof Danshen（including water-soluble phenolic acids and lipophilic tanshinones）was applied to UPLC-MS，and the similarity of 10 batchesofsampleswas analyzed.The common peak was determ ined，and identified by the MSdata.［Results］The UPLC-MS fingerprintof Danshen wasobtained，and 18 common fingerprintpeakswere indicated（including8water-soluble phenolic acidsand 10 lipophilic tanshinones），and 9 of them were identified by comparison with reference standards，and the similarities of the 10 samplesweremore than 0.90.［Conclusion］The method is reliableand stable，which can beused for the comprehensiveevaluation ofDanshen.

Salviam iltiorrhiza Bge.；UPLC-MS；fingerprint；quality control

R284.2

A

1672-1519（2015）07-0437-05

天津市科技創新專項資金項目（06FZZDSH00 408）；天津市西青區科技創新專項計劃項目（XQCXZX2012-006）；天津市西青區科技型中小企業發展專項資金項目（XQKC 2013-022）。

王洋（1981-），男，博士，主管藥師，研究方向為中藥體內外藥物分析和中藥藥理學。

李進，E-mail:lijin@shitian.com。

（2015-02-25）