羅布麻愈傷組織誘導和植株再生研究

李瑤，黃國慶，孫堯，王雷，吳瓊（黑龍江省科學院高技術研究院，哈爾濱150090）

羅布麻愈傷組織誘導和植株再生研究

李瑤，黃國慶，孫堯，王雷，吳瓊
（黑龍江省科學院高技術研究院，哈爾濱150090）

取羅布麻（Apocynum venetum L.）無菌苗中的葉、莖作為外植體，研究了不同激素組合對愈傷組織及不定芽分化的影響。結果表明：在多個激素濃度組合的培養基中，羅布麻的葉和莖的愈傷組織誘導率均能夠達到100%；但進行不定芽分化時，莖來源的愈傷組織在不同激素配比的培養基中有不定芽分化，最高分化率可達到56.7%。因此，在構建羅布麻再生體系時，選擇羅布麻莖段作為外植體，在培養基MS+6-BA 1.0m g/L+NAA 0.2m g/L中、光強2 500lx，每天光照時間12h、25±3℃的培養條件下誘導愈傷組織，并轉接到同樣的培養基中進行不定芽分化的誘導，最后在1/2MS培養基中加入適量的NAA進行生根培養。

羅布麻；愈傷組織；不定芽分化

羅布麻（Apocynum venetum L.），別稱紅麻、茶葉花、紅柳子等，為夾竹桃科羅布麻屬植物［1］，在我國新疆、青海、甘肅、寧夏、內蒙古、山東等省區均有分布［2-3］。羅布麻是一種抗逆性極強的植物，適于多種氣候和土質，可生長于河岸、海濱鹽地、干旱內陸地等。羅布麻的纖維價值極高，它的莖稈纖維可供紡織、造紙［4-5］。除此之外，羅布麻還有很高的藥用價值，它含有多種有效的化學成分，根、莖、花、葉均可入藥，具有降血脂、降血壓、抗炎、抗過敏等多種效用［6-7］。羅布麻是一種集鹽堿地綠化、纖維價值、藥用價值于一體的野生優良水土保持植物，對于荒漠化的治理具有積極意義［8］。

野生狀態下的羅布麻種子繁殖成活率不高、生長遲緩、成林時間較長［9］。而且，野生羅布麻的質量不穩定［10］。在取材時，對其生長的土壤環境也會造成深層次的破壞［11］。目前，也曾有人工栽培的報道，但在實際操作中受到環境因素的限制，且種子繁殖技術出苗率低，生長周期長［12］。鑒于此，本研究以羅布麻幼苗的莖段、葉片作為外植體，探討愈傷組織誘導、不定芽再生及生根誘導的最佳條件，為種苗的快速繁殖及進一步的轉基因操作奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗材料

吉林省采集的野生羅布麻種子，消毒后接種于MS培養基中，所得無菌苗的幼嫩莖段作為外植體。

1.1.2培養基

表1　用于羅布麻組織培養的培養基Tab.1 Tissue culture m edium s fo r apocynum

羅布麻為耐鹽植物，選擇高鹽培養基MS培養基作為構建羅布麻再生體系的基本培養基［13］。添加生長素NAA（0.1～0.4mg/g）與細胞分裂素6-BA（0.5～2.0mg/g）配合誘導愈傷組織及不定芽的分化，具體激素組合見表1［14-15］。采用1/2MS培養基并添加生長素NAA（0.1～0.4mg/g）進行生根培養的誘導（見表2）［16-17］。

表2　生根誘導培養基Tab.2 Root induction cultu re medium

1.2方法

1.2.1無菌苗的獲得

選取成熟飽滿的羅布麻種子，放于10%的次氯酸鈉溶液中浸泡消毒5m in，用無菌水沖洗5～6次，接種于MS培養基上，每瓶5個，置于光強2 500lx、光照時間16h，溫度25±3℃的光照培養箱中進行培養，待無菌苗長至7cm左右時，取其莖段用于羅布麻再生體系的構建。

1.2.2愈傷組織誘導

取無菌苗的莖段及葉片，剪成一定大小（莖段0.5cm左右、葉片0.04cm2左右），接種于表1中相應的各培養基中進行愈傷組織的誘導。每瓶接種10個外植體，每個濃度接種3瓶共計30個，培養條件為光強2 500lx、光照時間12h，溫度25±3℃［14］。

1.2.3不定芽的分化

待愈傷組織增殖至直徑約0.5cm時，挑取新鮮、質地緊密的愈傷組織轉接到表1的各培養基中，進一步進行不定芽的誘導。每瓶接種10個外植體，每個濃度接種3瓶共計30個，培養條件為光強2 500lx、光照時間12h，溫度25±3℃［14］。

1.2.4不定根的誘導

待羅布麻分化出不定芽后，取芽叢中高約3～4cm的不定芽剪下，接種于生根培養基上進行生根誘導。每瓶接種7個或8個不定芽，每個濃度4瓶共計30個，培養條件為培養條件為光強2 500lx、光照時間12h，溫度25±3℃［18］。

1.2.5結果統計

愈傷組織誘導率（%）=愈傷塊數/接種個數× 100；不定芽分化率（%）=出芽愈傷塊數/愈傷個數×100；不定根誘導率（%）=生根個數/不定芽個數× 100。

2　結果與分析

2.1愈傷組織誘導結果

MS培養基添加生長素NAA與細胞分裂素6-BA誘導愈傷組織。在激素施用的濃度范圍內，羅布麻莖段及葉片均有愈傷組織發生。外植體接種3～4d后，葉片顏色變淡、拱起，莖段出現節狀增粗、失綠；7d后，顆粒狀愈傷組織從切面處長出，繼而長滿外植體表面，使莖段及葉片發生不同程度的膨大（見圖1）。羅布麻莖段在9個不同激素組合梯度培養基中，有6種激素組合的誘導率達到了100%，具體結果如表3所示。羅布麻葉片盡在編號4的激素組合下誘導率達到100%，具體結果見表4。由此可知，羅布麻的莖和葉均可作為外植體材料誘導愈傷組織，其中，使用莖段誘導愈傷組織效果更佳。

圖1　愈傷組織Fig.1 Callus

表3　羅布麻莖段誘導愈傷組織結果統計Tab.3 Apocynum stem callus statistical resu lts

表4　羅布麻葉片誘導愈傷組織結果統計Tab.4 Apocynum leaves callus sta tistical results

2.2不定芽分化結果

挑取愈傷組織進行不定芽分化誘導培養，10d后，有紅色不定芽從莖段的愈傷組織上分化，而葉片的愈傷組織則未見不定芽分化。5d后，不定芽開始形成芽叢（見圖2）。不定芽分化誘導的具體結果如表5所示。由此可知，莖段產生的愈傷組織，在培養基MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L中，分化率最高，可達到56.7%。

圖2　莖愈傷組織上的不定芽Fig.2 Adventitious buds from callus o fstem

2.3生根誘導結果

不定芽生根培養是在1/2MS培養基上加入NAA進行誘導。在4個NAA供試濃度下，不定根的發生率均可達到100%。不定根健壯，長勢較好。

根據試驗結果可知，在構建羅布麻再生體系時，可選擇羅布麻莖段作為外植體，在培養基MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L中、光強2 500lx，每天光照時間12h、25±3℃的培養條件下誘導愈傷組織，并轉接到同樣的培養基中進行不定芽分化的誘導，最后在1/2MS培養基中加入適量的NAA進行生根培養。

表5　羅布麻莖段誘導不定芽分化結果統計Tab.5 The statistical results of induced apocynum stem bud differentiation

3　結語

本試驗采用羅布麻組織培養中較為常用的MS作為基礎培養基，添加不同組合和配比的生長素NAA及細胞分裂素6-BA，以羅布麻無菌苗的莖段及葉片為外植體進行羅布麻植株再生的研究。根據羅布麻愈傷組織誘導、不定芽分化及不定根誘導的試驗結果，可以得出構建羅布麻再生體系的最佳條件，即選擇羅布麻莖段作為外植體，在培養基MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L中、光強2 500lx，每天光照時間12h、25±3℃的培養條件下誘導愈傷組織，并轉接到同樣的培養基中進行不定芽分化的誘導；生根培養可選擇在1/2MS培養基中加入適量的NAA。在這一過程中，羅布麻愈傷組織誘導率可達到100%，不定芽分化率可達到56.7%，不定根的誘導率可達到100%。由此可知，羅布麻愈傷組織誘導及生根誘導相對較容易，提高不定芽分化率是建立高效再生體系的關鍵。

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Research on Apocynum Callus Induction and Plant Regeneration

LIYao，HUANGGuo-qing，SUNYao，WANGLei，WUQiong
（InstituteofAdvanced Technology，Heilongjiang Academy ofSciences，Harbin 150090，China）

Thispaper takes the leaves，stemsofapocynum ofno vaccine asexplants to study the effectof different hormones on callus and adventitious bud differentiation.The results showed that a combination of hormone concentrations inmultiplemedia，callus induction rateofapocynum leaves and stems could reach 100%；butwhen adventitious buds，stems sources callus bud differentiation in culture has different hormone combinations，the highestdifferentiation rate reached 56.7%.Therefore，when constructing apocynum regeneration system，apocynum stem segmentswere selected asexplants，in themedium MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L，the light intensity 2500lx，day light time 12h，25 callus culture conditions±3℃and transferred to the samemedium to induce differentiation ofadventitiousbuds.In themoderate NAA addition of1/2MSm medium，itwas cultured by rooting.

Apocynum；Callus；Adventitiousbuds.

S563.7

A

1674-8646（2015）05-0015-03

2015-03-09

李瑤（1987-），女，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，工程師，主要從事植物基因工程研究。