皮秒脈沖電場對宮頸癌侵襲能力影響的實驗研究

吳麗梅，華媛媛，吳雨桐，姚陳果，張睿哲，王智亮，熊正愛

2012年國際癌癥研究機構(gòu)公布的全球腫瘤流行病學(xué)統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，發(fā)展中國家宮頸癌新增病例44.45萬，其中死亡病例23.02萬，分別居所有新增病例和死亡病例的第2﹑3位[1]。雖然世界各國的研究人員都在致力于探索新的宮頸癌治療策略[2-4]，但是目前的手術(shù)治療及放﹑化療效果有限，且不良反應(yīng)明顯[5-7]，其臨床應(yīng)用前景不容樂觀。皮秒脈沖電場作為一種新興的物理治療方法，具有較高的時間和空間分辨率，信號失真小，并能避免對正常組織的損傷，從而能實現(xiàn)腫瘤的無創(chuàng)治療，但其對腫瘤的作用及機制研究尚處于初步階段。本研究從組織水平研究皮秒脈沖電場對宮頸癌的組織殺傷效應(yīng)及其對宮頸癌侵襲能力的影響，以期推動該技術(shù)盡早進入臨床，為宮頸癌患者提供一種無創(chuàng)的保留生育功能的新方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 10%水合氯醛(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院)，抗基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)單克隆抗體(Santa Cruz公司)，抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)多克隆抗體(北京博奧森生物科技有限公司)；皮秒脈沖電場發(fā)生儀(重慶市重慶大學(xué)輸配電裝備及系統(tǒng)安全與新技術(shù)國家重點實驗室制造并調(diào)試)﹑示波器(Tektronix TDS3032B，USA)﹑鑷型電極(重慶市重慶大學(xué)輸配電裝備及系統(tǒng)安全與新技術(shù)國家重點實驗室提供)。

1.2 實驗動物 24只4～6周齡健康雌性BALB/c裸鼠由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，體重14.0～18.0g，飼養(yǎng)于無特殊病原體的環(huán)境中，實驗前先于該環(huán)境中適應(yīng)3～5d。1.3 宮頸癌移植瘤模型制作 消毒上述裸鼠腹股溝根部待接種部位，注射混勻的HeLa細(xì)胞懸液0.2ml(含細(xì)胞5×106個)，20～25d后待腫瘤最大直徑長至0.5～0.8cm時，采用10%水合氯醛(70μl/20g)麻醉裸鼠，取皮下腫瘤組織置于冰上的培養(yǎng)皿中剪碎至1mm×1mm×1mm大小，消毒待接種的裸鼠左上肢根部皮膚，將組織塊迅速接種于裸鼠皮下，對合皮膚并消毒，每隔1d觀察移植瘤生長情況，約20d后成功建立宮頸癌移植瘤動物模型備用。

1.4 psPEF電場處理裸鼠移植瘤 10%水合氯醛麻醉待處理裸鼠，常規(guī)消毒腫瘤區(qū)域皮膚，根據(jù)腫瘤的形態(tài)選擇適當(dāng)?shù)蔫囆坞姌O擺放位置，盡可能使其作用范圍覆蓋整個腫瘤區(qū)域。按皮秒脈沖電場場強不同隨機將宮頸癌模型動物分為4組：對照組﹑場強50kV/cm組﹑場強60kV/cm組﹑場強70kV/cm組，每組6只裸鼠。脈沖電場參數(shù)設(shè)定：固定頻率為3Hz，脈寬為800ps，脈沖個數(shù)為2000個，每只裸鼠處理時間11min。對照組不予以任何處理。然后繼續(xù)在上述環(huán)境中飼養(yǎng)1周，期間每隔1d觀察裸鼠移植瘤生長情況，裸鼠的精神及飲食狀況。

1.5 裸鼠移植瘤的組織學(xué)觀察 皮秒脈沖電場處理后1周頸椎脫臼法處死裸鼠，立即取腫瘤組織，放入4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋﹑切片﹑HE染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)的改變；同時將即刻取下的腫瘤切取2～3個1mm3大小的組織塊，4%戊二醛固定，送重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院電子顯微鏡室脫水，環(huán)氧樹脂浸透，包埋﹑聚合，超薄切片，鈾/鉛染色，應(yīng)用Hitachi-7500型透射電鏡觀察組織超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.6 免疫組化檢測VEGF﹑MMP-9的表達 用兔多克隆抗體VEGF﹑鼠單克隆抗體MMP-9檢測腫瘤組織內(nèi)VEGF﹑MMP-9的表達，免疫組化染色按SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)說明書進行，采用Image-pro plus 6.0對圖片的平均光密度值進行分析。

1.7 Western blotting檢測 皮秒脈沖處理后1周，頸椎脫臼法處死裸鼠，立即取腫瘤組織放入液氮中保存，Western blotting檢測腫瘤組織內(nèi)VEGF﹑MMP-9的表達情況，以GAPDH為內(nèi)參，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描制片并行半定量分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 宮頸癌荷瘤裸鼠模型的建立 腫瘤組織接種裸鼠皮下后1周可于接種部位見明顯的腫瘤生長，接種后20d腫瘤長至0.6～0.8cm大小，可用于皮秒脈沖處理(圖1)。

2.2 皮秒脈沖電場對宮頸癌組織的殺傷效應(yīng)

2.2.1 HE染色結(jié)果 光鏡下，對照組可見大量腫瘤細(xì)胞活躍生長，細(xì)胞密集，間質(zhì)少，細(xì)胞核呈圓形﹑不規(guī)則形，核大，核仁明顯，核分裂象多見；50kV/cm處理組腫瘤組織周邊仍可見較大范圍的癌細(xì)胞生長，壞死主要集中在中間區(qū)域，壞死組織內(nèi)夾雜少許癌細(xì)胞；60kV/cm處理組腫瘤組織周邊癌細(xì)胞較50kV/cm組減少，中央壞死區(qū)域增大，壞死較徹底，少數(shù)可見壞死細(xì)胞輪廓；70kV/cm處理組腫瘤組織周邊僅見3～4層腫瘤細(xì)胞，可見少數(shù)壞死細(xì)胞輪廓(圖2)。

圖1 皮秒脈沖電場作用于裸鼠皮下移植瘤(箭頭示鑷形電極)Fig. 1 psPEF acted on the subcutaneous transplanted tumor Arrow shows the tweezers type plate electrodes

2.2.2 電鏡檢測結(jié)果 電鏡下，對照組腫瘤細(xì)胞核漿比大，核仁大而明顯，可見少量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，細(xì)胞間連接清晰可見；50kV/cm處理組胞質(zhì)內(nèi)線粒體輕﹑中度腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕﹑中度擴張，細(xì)胞核改變不明顯，細(xì)胞間連接輕度減少；60kV/cm處理組腫瘤細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體明顯腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴張，細(xì)胞器部分受損，輪廓不清，胞核異染色質(zhì)凝聚成團塊狀，并向核周邊集；70kV/cm處理組腫瘤細(xì)胞大量壞死，鏡下見大量細(xì)胞碎片，細(xì)胞器嚴(yán)重受損，不能辨認(rèn)其結(jié)構(gòu)，腫瘤細(xì)胞輪廓消失(圖3)。

圖2 各組腫瘤組織HE染色切片(×200)Fig. 2 HE staining of tumor tissue in each group (×200)

2.3 皮秒脈沖電場對宮頸癌細(xì)胞侵襲能力的影響

2.3.1 免疫組化檢測結(jié)果 VEGF主要分布于胞質(zhì)和基質(zhì)中，MMP-9主要分布于胞質(zhì)。對照組組織中陽性瘤細(xì)胞數(shù)目多，胞質(zhì)染色較深，呈棕黃色，皮秒脈沖處理組隨著脈沖場強的增加陽性瘤細(xì)胞數(shù)逐漸減少，染色逐漸變淺，呈淺黃色，尤其在70kV/cm處理組，極少見陽性瘤細(xì)胞(圖4)。運用Image-Pro Plus 6.0軟件對免疫組化圖片進行光密度值測量，結(jié)果如表1所示：經(jīng)皮秒脈沖電場處理后，腫瘤組織中VEGF和MMP-9蛋白的平均光密度值較對照組明顯下降，且隨著脈沖電場強度的增強，平均光密度值呈逐漸下降趨勢，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組VEGF和MMP-9的平均光密度值變化(±s，n=6)Tab. 1 The average optical density of VEGF and MMP-9 in each group (±s, n=6)

表1 各組VEGF和MMP-9的平均光密度值變化(±s，n=6)Tab. 1 The average optical density of VEGF and MMP-9 in each group (±s, n=6)

(1)P＜0.05 compared with control group; (2)P＜0.05 compared with 50kV/cm group; (3)P＜0.05 compared with 60kV/cm group

Group VEGF MMP-9 Control 0.151±0.012 0.146±0.011 50kV/cm 0.102±0.014(1) 0.100±0.016(1)60kV/cm 0.081±0.009(1)(2) 0.064±0.007(1)(2)70kV/cm 0.022±0.004(1)(2)(3) 0.014±0.002(1)(2)(3)

圖4 VEGF﹑MMP-9表達的免疫組化分析(×400)Fig. 4 Expression of VEGF and MMP-9 in each group (IHC staining ×400)

2.3.2 Western blotting檢測結(jié)果 隨著皮秒脈沖電場強度的增加，VEGF和MMP-9的蛋白表達水平逐漸下降(P＜0.05)。運用Quantity One灰度定量分析軟件計算各條帶的灰度值，并計算出目的條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值，結(jié)果顯示：處理組VEGF的灰度值(50kV/cm組0.666±0.055，60kV/cm組0.511±0.032，70kV/cm組0.305±0.023)明顯低于對照組(0.818±0.043)，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且60﹑70kV/cm組明顯低于50kV/cm組(P＜0.05)，但60﹑70kV/cm組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。處理組MMP-9的灰度值(50kV/cm組0.818±0.040，60kV/cm組0.656±0.062，70kV/cm組0.464±0.027)也明顯低于對照組(1.006±0.027，P＜0.05)，且60﹑70kV/cm組明顯低于50kV/cm組(P＜0.05)，但60﹑70kV/cm組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖5)。

圖5 皮秒脈沖電場對VEGF﹑MMP-9蛋白表達的影響Fig. 5 Effect of psPEF on the protein expression of VEGF and MMP-9

3 討 論

近年來，世界各國的研究人員都致力于探索新的宮頸癌治療策略[8-10]，脈沖電場作為一種新興的物理治療方法逐漸被人們所重視。目前國內(nèi)外研究者已對毫秒級﹑微秒級﹑納秒級脈沖電場進行了大量研究，并取得了較大進展[11-14]，但其有創(chuàng)性限制了在臨床上的應(yīng)用。皮秒脈沖電場通過沖激脈沖輻射天線可無創(chuàng)地將脈沖電場傳輸至生物組織內(nèi)部，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時可避免對正常組織的損傷[15]。本課題組前期研究證實，psPEF對宮頸癌動物模型具有在體殺傷效應(yīng)，而該效應(yīng)可能與線粒體膜電位下降及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激活化Caspase依賴的細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)[16]。但是我們同樣觀察到，皮秒脈沖作用后，腫瘤組織內(nèi)仍殘存少量癌細(xì)胞，而該部分癌細(xì)胞可能是后期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的隱患。因此，本課題在前期實驗的基礎(chǔ)上，重點對皮秒脈沖電場作用后殘存腫瘤細(xì)胞的侵襲能力進行了初步研究。

腫瘤的侵襲過程主要包括腫瘤細(xì)胞的黏附﹑細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解和細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[17]。在這個過程中MMP-9和VEGF發(fā)揮著重要作用，其中MMP-9主要發(fā)揮降解ECM的作用[18]，而VEGF在腫瘤新生血管形成﹑腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮著重要作用[19]。本實驗通過觀察psPEF作用于裸鼠宮頸癌移植瘤后的組織學(xué)改變發(fā)現(xiàn)，psPEF能強有力地殺傷宮頸癌細(xì)胞，且在一定場強范圍內(nèi)隨著脈沖電場強度的增強，殺傷效應(yīng)逐漸增強，電鏡觀察可見大量不同形式的異染色質(zhì)凝聚成塊狀﹑核溶解等，該結(jié)果符合本課題組前期實驗結(jié)果[20]。此外，本研究結(jié)果還顯示，促血管生成相關(guān)因子VEGF及基質(zhì)降解相關(guān)蛋白MMP-9的表達隨著脈沖電場強度的增強而逐漸降低，其中以70kV/cm組最為明顯，說明psPEF可以抑制殘存宮頸癌組織ECM的降解，減少腫瘤細(xì)胞周圍營養(yǎng)血管的生成，從而降低其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能。以上結(jié)果初步表明，psPEF在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，還可抑制殘存腫瘤細(xì)胞分泌VEGF和MMP-9，能在一定程度上降低治療后的復(fù)發(fā)和局部殘存癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，降低其侵襲能力。但psPEF發(fā)揮該作用的機制并不清楚，我們推測可能是其引起了腫瘤內(nèi)部微環(huán)境的變化，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞分泌功能的異常。

綜上所述，psPEF具有抗宮頸癌的效應(yīng)，該效應(yīng)可能包括兩個方面：直接作用于宮頸癌細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡；間接調(diào)控腫瘤內(nèi)部微環(huán)境，抑制殘存腫瘤細(xì)胞VEGF﹑MMP-9的分泌。二者協(xié)同在宮頸癌治療及提高宮頸癌患者遠(yuǎn)期生存率上具有很好的臨床應(yīng)用前景。但是由于目前的研究僅處于初步階段，因此psPEF對宮頸癌的具體作用機制仍有待進一步完善。

[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2012, 65(2): 87-108.

[2] Eskander RN, Tewari KS. Targeting angiogenesis in advanced cervical cancer[J]. Ther Adv Med Oncol, 2014, 6(6): 280-292.

[3] Ma J, Waxman DJ. Combination of antiangiogenesis with chemotherapy for more effective cancer treatment[J]. Mol Cancer Ther, 2008, 7(12): 3670-3684.

[4] Ackermann M, Carvajal IM, Morse BA, et al. Adnectin CT-322 inhibits tumor growth and affects microvascular architecture and function in Colo205 tumor xenografts[J]. Int J Oncol, 2011,38(1): 71-80.

[5] Verheul HM, Pinedo HM. Possible molecular mechanisms involved in the toxicity of angiogenesis inhibition[J]. Nat Rev Cancer, 2007, 7(6): 475-485.

[6] Speiser D, Mangler M, K?hler C, et al. Fertility outcome after radical vaginal trachelectomy: a prospective study of 212 patients[J]. Int J Gynecol Cancer, 2011, 21(9): 1635-1639.

[7] Lloyd PA, Briggs EV, Kane N, et al. Women's experiences after a radical vaginal trachelectomy for early stage cervical cancer. A descriptive phenomenological study[J]. Eur J Oncol Nurs, 2014,18(4): 362-366.

[8] Liu XJ, Hou B, Song XJ, et al. The efficacy of Endostar combined with co-chemoradiotherapy for stage Ⅲ bulky cervical cancer[J]. J Logist Univ PAPF (Med Sci), 2013, 22(3): 178-181.[劉興京, 侯兵, 宋曉軍, 等. 恩度聯(lián)合同步放化療治療Ⅲ期巨塊型宮頸癌的臨床療效觀察[J]. 武警后勤學(xué)院學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2013, 22(3): 178-181.]

[9] Liu HL, Lu CS, Ding BJ, et al. Photodynamic effect of new photodynamic therapy combined with nucleolin silenceon cervical cancer cell line SiHa[J]. J Jilin Univ (Med Ed), 2014,40(4): 748-752, 915. [劉洪麗, 呂昌帥, 丁佰娟, 等. 新型光動力學(xué)療法聯(lián)合核仁素沉默對宮頸癌SiHa細(xì)胞的光動力學(xué)效應(yīng)[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2014, 40(4): 748-752, 915.]

[10] Wang J, Zhang YZ, Feng JB, et al. Inhibitive effects of lenti virus-mediated hTERT RNA interference and TMPyP4-PDT on cervix cancer SiHa cells[J]. J Shandong Univ (Health Sci),2015, 53(1): 27-33. [王頡, 張友忠, 馮進波, 等. 慢病毒介導(dǎo)的hTERT-shRNA聯(lián)合光動力治療對宮頸癌細(xì)胞SiHa的影響[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2015, 53(1): 27-33.]

[11] Cemazar M, Parkins CS, Holder AL, et al. Electroporation of human microvascular endothelial cells: evidence for an antivascular mechanism of electrochemotherapy[J]. Br J Cancer,2001, 84(4): 565-570.

[12] Nuccitelli R, Chen X, Pakhomov AG, et al. A new pulsed electric field therapy for melanoma disrupts the tumor's blood supply and causes complete remission without recurrence[J]. Int J Cancer, 2009, 125(2): 438-445.

[13] Chen X, Chen X, Swanson RJ, et al. Histopathological follow-up by tissue micro-array in a survival study after melanoma treated by nanosecond pulsed electric fields (nsPEF)[J]. J Dermatolog Treat, 2011, 22(3): 153-161.

[14] Chen X, Zhuang J, Kolb JF, et al. Long term survival of mice with hepatocellular carcinoma after pulse power ablation with nanosecond pulsed electric fields[J]. Technol Cancer Res Treat,2012, 11(1): 83-93.

[15] Jia J, Xiong ZA, Qin Q, et al. Picosecond pulsed electric fields induce apoptosis in a cervical cancer xenograft[J]. Mol Med Rep, 2015, 11(3): 1623-1628.

[16] Hua YY, Xiong ZA, Zhang Y, et al. Growth and apoptosis of HeLa cells induced by intense picosecond pulsed electric field[J]. Med J Chin PLA, 2011, 36(7): 711-713. [華媛媛, 熊正愛, 張玉, 等.高強度皮秒脈沖電場對人宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長抑制及凋亡誘導(dǎo)作用[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 36(7): 711-713.]

[17] Leber MF, Efferth T. Molecular principles of cancer invasion and metastasis (review)[J]. Int J Oncol, 2009, 34(4): 881-895.

[18] Roomi MW, Kalinovsky T, Cha J, et al. Effects of a nutrient mixture on immunohistochemical localization of cancer markers in human cervical cancer HeLa cell tumor xenografts in female nude mice[J]. Exp Ther Med, 2015, 9(2): 294-302.

[19] Nagy VM, Buiga R, Brie I, et al. Expression of VEGF, VEGFR,EGFR, COX-2 and MVD in cervical carcinoma, in relation with the response to radio-chemotherapy[J]. Rom J Morphol Embryol, 2011, 52(1): 53-59.

[20] Qin Q, Xiong ZA, Jia J. In vivo effects of picosecond pulse electric field on nude rat model of cervical cancer[J]. J Third Mil Univ, 2014, 36(23): 2372-2376. [秦琴, 熊正愛, 賈佳. 皮秒脈沖電場治療宮頸癌動物模型的體內(nèi)效應(yīng)研究[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2014, 36(23): 2372-2376.]