光甘草定羥丙基-β-環糊精包合物的制備及其對透皮吸收的影響研究

葉柳青，王　艷，韓宛盈，周曉霞，馬宗武，崔廣智

（天津中醫藥大學中藥學院，天津300193）

光甘草定羥丙基-β-環糊精包合物的制備及其對透皮吸收的影響研究

葉柳青，王艷，韓宛盈，周曉霞，馬宗武，崔廣智

（天津中醫藥大學中藥學院，天津300193）

［目的］優化光甘草定（GLA）羥丙基-β-環糊精包合物（HP-β-CD）的制備工藝，并考察其對體外透皮吸收的影響。［方法］采用正交實驗，考察物料比、包合溫度、包合時間對GLA包合率的影響。包合率為指標篩選最佳制備工藝。用Franz擴散池進行透皮吸收實驗，研究HP-β-CD對GLA透皮吸收的影響。［結果］HP-β-CD包合GLA的優化工藝是質量倍數為15倍的HP-β-CD，40℃下包合1.5 h。光甘草定HP-β-CD包合物累積透過量高于光甘草定單體組。［結論］HP-β-CD能促進光甘草定的經皮滲透。

光甘草定；羥丙-β-環糊精；透皮吸收

光甘草定（GLA）為疏水性異黃酮類化合物，是光果甘草（Glycyrrhiza glabral）中的特有成分［1］，具有廣泛的生物活性，如預防動脈粥樣硬化［2］，抗炎［3］，抗骨質疏松［4］，神經保護作用［5］等。值得注意的是GLA可以抑制酪氨酸酶活性，阻礙皮膚的黑色素生成［3］，在化妝品領域被稱為“美白黃金”。但是GLA幾乎不溶于水，這就限制了其在外用制劑中的應用。藥物經環糊精包合后，再經離體透皮吸收，藥物的累積透過量明顯增加［4］，其中羥丙基-β-環糊精包合物（HP-β-CD）能夠提高難溶物質的溶解度，同時有利于提高包合物的穩定性［6-7］。

本研究以HP-β-CD作為包合材料，制備GLA的HP-β-CD包合物（GLA-HP-β-CD），并考察HP-β-CD對GLA透皮吸收的影響。

1　儀器與試劑

島津LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津），FA 1004型萬分之一分析天平（上海精科天平），TBP6型改良Franz透皮擴散實驗儀（上海諧凱），84-II型磁力恒溫攪拌器（山東甄城永興），KQ-300 B型超聲波清洗器（昆山超聲儀器），LGJ-12型冷凍干燥機（北京松源華興）。

GLA對照品（純度＞98%，中國藥品生物制品鑒定所），HP-β-CD（山東濱州智源生物），色譜純乙腈和甲醇（天津康科德），分析純乙醇、冰乙酸和氯化鈉（天津康科德），生理鹽水（實驗室自制），甘油、硬脂酸和單硬脂酸甘油酯（天津光復精細化工），昆明種實驗小鼠［（20±3）g，北京華阜康］。

2　方法

2.1GLA含量測定方法的建立

2.1.1色譜條件色譜柱：Hypersil ODS（4.6 mm× 200 mm，5 μm），流動相：乙腈-水-冰乙酸（55∶44∶1），流速：1mL/min，檢測波長：280 nm，進樣量固定為10 μL，柱溫：25℃［8］。

2.1.2對照品溶液制備稱取GLA對照品適量，以甲醇溶解，制得濃度為91.2 μg/mL的對照品儲備液。

2.1.3線性關系考察將對照品儲備液稀釋，得到一系列GLA溶液，按2.1.1項下進行色譜分析，高相液相色譜法（HPLC）圖譜見圖1，以進樣量為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y），在0.912～9.12 mg/L進行線性回歸，得到回歸方程=142 651.024 7X+ 25 286，r=0.999 4。

2.1.4精密度實驗取同一對照品溶液，按2.1.1項下進行色譜分析，連續6次，吸取同一對照品溶液，按2.1.1項下進行色譜分析，連續6 d，記錄峰面積積分值，GLA質量濃度的RSD分別為0.54%和0.28%，表明GLA的日內和日間精密度均良好。

2.1.5重復性實驗取同一接收池中的GLA軟膏接受液6份，按2.1.1項下進行色譜分析，計算得其質量濃度的RSD為0.82%，表明該方法重復性良好。

2.1.6穩定性實驗吸取上述同一對照品溶液，分別在0、1、2、4、6、8、10、12 h按2.1.1項下進行色譜分析，計算得其質量濃度的RSD%為0.40%，表明GLA在12 h內穩定。

2.2GLA-HP-β-CD及其軟膏的制備

2.2.1GLA-HP-β-CD的制備以投料量比、包合溫度、包合時間為因素，包合率作為評價指標，正交因素水平。見表1。

表1　因素水平表Tab.1 Factors and levels orthogonal table

按照上述因素水平表中投料比稱取相應質量的HP-β-CD和GLA，HP-β-CD加入適量蒸餾水中，按設置規定溫度及轉速磁力攪拌器，攪拌至溶解。GLA用少量無水乙醇溶解，逐滴加入HP-β-CD溶液中，繼續攪拌至規定時間得到包合物。將不同條件下制得的GLA-HP-β-CD置于冰箱中冷藏1 h，抽濾，濾液放入冰箱中冷藏24 h，真空冷凍干燥得發黃蓬松塊狀物，即得GLA-HP-β-CD［9-10］。

2.2.2GLA-HP-B-CD軟膏的制備按照如下表2中處方分別制備空白軟膏，GLA軟膏和GLA-HP-β-CD軟膏。

表2　不同GLA軟膏處方表Tab.2 Different prescription of glabridin ointments table

2.3GLA-HP-β-CD軟膏對經皮吸收的影響

2.3.1離體鼠皮的制備取質量（20±2）g的昆明種小鼠，脫去其腹部被毛，剪下腹部皮膚，除去粘連的脂肪組織，以生理鹽水為儲存液置于4℃的冰箱中保存備用［11］，臨用時吸干皮膚表面水分。

圖1　GLA對照品溶液（A）、GLA-HP-β-CD（B）、空白軟膏透皮吸收液（C）、GLA-HP-β-CD軟膏透皮接受液（D）的HPLC圖Fig.1HPLC chromatograms of glabridin reference substances solution（A），glabridin HP-β-CD solution（B），blank ointment sample solution（C），transdermal solution after application of glabridin HP-β-CD（D）

2.3.2實驗方法處理好的鼠皮角質層向上固定于Franz擴散池上，接收池中加入30%的乙醇-生理鹽水溶液7.5 mL，使鼠皮內層完全與接受液接觸，打開透皮儀并設定恒溫37℃，保持恒定轉速200 r/min［12］。平衡1 h，排盡接收池內的氣泡后給藥。擴散池供給鼠皮面積上均勻涂上0.1 gGLA軟膏，每組平行3次，分別在1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h時吸取接收液1 mL，每次取樣后均補入相同體積的接收液［13］，按2.1.1方法進樣分析。

3　實驗結果與分析

3.1GLA的HPLC色譜結果GLA含量測定HPLC色譜圖，見圖1。

3.2GLA包合物含量測定精密稱取GLA-HP-BCD置于5 mL量瓶內，用甲醇定容，超聲30 min，按照上述色譜條件，HPLC法測定峰面積，每個樣品測定3次，取平均值，帶入公式［14］。

GLA-HP-B-CD含量測定結果見表3，方差分析見表4。

表3　正交實驗結果Tab.3Results of orthogonal test

表4　包合率方差分析Tab.4Analysis of variance for inclusion efficiency

由表3可知，各因素影響包合率的順序為A＞C＞B。由表4可知，投料質量比對包合率有顯著影響［15］。綜合以上數據得出最佳包合工藝為A1B1C1，即包合條件為GLA和HP-β-CD投料質量比為1∶15，包合溫度為40℃，包合時間為1.5 h。

3.3驗證實驗按照上述最佳工藝條件，平行3組實驗，得到的包合率分別為73.42%、73.44%、73.41%，平均包合率為73.42%，與正交實驗得出的最佳工藝條件基本一致。見表5。

表5　驗證實驗結果Tab.5Results of verification experiments

3.4GLA及其包合物經皮給藥實驗結果

3.4.1數據計算方法取“2.3.2”項所取樣品，按2.1.1方法進樣分析，測定GLA的含量，根據下列公式計算GLA的累積透過量（Qn，μg/cm2）［16］。

Qn=（CnV+ΣCiVi）/A

Cn：第n個時間點吸取液的濃度mg/L

Ci：第n-i個時間點吸取液的濃度mg/L

V：接收液的總體積即7.5 mL

Vi：每次吸取的液體體積即1 mL

A：接收池的體積即1 cm2

3.4.2透皮吸收結果考察了GLA及GLA-HP-β-CD的透皮吸收效果，按2.2.2的方法制備GLA軟膏及GLA-HP-β-CD軟膏，按2.3.2方法進行透皮吸收實驗，按2.1.1方法測定GLA含量，并計算GLA累積透過量。GLA及GLA-HP-β-CD的透皮吸收結果，以取樣時間t為橫坐標，以GLA累積透過量Qn為縱坐標作圖。見圖2。

圖2　GLA及GLA-HP-β-CD軟膏累積透過量曲線Fig.2Profile of accumulative permeation amount of glabridin and glabridin HP-β-CD

由圖2可以看出，GLA-HP-β-CD的累積透過量大于GLA軟膏的累積透過量，兩者經t檢驗，有顯著性差異（P＜0.05）。結果表明HP-β-CD能夠促進GLA的透皮吸收，有利于GLA在制劑中的應用。

4　討論

GLA為疏水性異黃酮類化合物，應用到化妝品中存在的一個難題是在皮膚中的滲透量很小，從而在實際應用中影響其美白祛斑效果。本文的目的是采用HP-β-CD包合GLA，以增加GLA的水溶性，并考察包合后的GLA在體外經皮吸收的滲透量。實驗采用直接攪拌法制備GLA環糊精包合物，此方法制備過程簡便，易操作，耗費時間短［17］。以包合率為檢測指標，測定GLA-HP-β-CD的含量，優化得到最佳包合工藝即投料比為GLA∶HP-β-CD=1∶15（質量比），包合溫度為40℃，包合時間為1.5 h。將GLA-HP-β-CD制備成軟膏后，通過經皮給藥實驗結果表明，HP-β-CD能夠促進GLA的透皮吸收，其原因可能與增大GLA的溶解度和穩定性有關［18］，下一步將對原因進一步探討。

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（本文編輯：高杉，滕曉東）

Study on preparation of glabridin hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion compound and its effect of transdermal absoption

YE Liu-qing，WANG Yan，HAN Wan-ying，ZHOU Xiao-xia，MA Zong-wu，GUI Guang-zhi
（School of Chinese Materia Medica，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To optimize the preparation technology of glabridin hydroxypropyl-β-cyclodextrin（HP-β-CD）inclusion compound and investigate its effect of transdermal absoption.［Methods］With inclusion efficiency as the indice，the optimum preparation condition was studied by orthogonal test.Franz vertical diffusion cell was adopted to investigate transdermal performance of glabridin HP-β-CD.［Results］The optimal inclusion conditions were as follows：the ratio of glabridin to HP-β-CD was 1∶15（m/m），inclusion temperature was 40℃，inclusion time was 1.5 h.The cumulative permeation of glabridin HP-β-CD was higher than glabridin group.［Conclusion］HP-β-CD have significant effect on transdermal of glabridin.

glabridin；HP-β-CD；transdermal absoption

R285

A

1672-1519（2015）10-0622-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.10.11

西青區科技型中小企業發展專項資金項目（XQKH2013-011）；天津中醫藥大學第四屆大學生科技創新基金項目（CXJJ2013ALL）。

葉柳青（1989-），女，碩士研究生，研究方向為中藥藥劑。

王艷，E-mail：paozhijiaoxue@126.com。

（2015-05-14）