辣椒花蕾長度和單核靠邊期花粉細胞比例間的關系

胡梅　高杰　葛菊芬　許建　朱君芳　王娜

摘 要：為了提高辣椒游離小孢子培養時取材的準確性，采用DAPI熒光染色法對4個不同品種類型的辣椒材料（Pimiento、HXR-WU-02、豬大腸及Chile Guajillo）5個不同長度區組的花蕾進行染色觀察，研究辣椒的花蕾長度與其花粉中小孢子單核靠邊期比例之間的相關性。結果表明，不同品種辣椒花蕾長度與小孢子單核靠邊期比例之間存在差異性。且當花蕾長為4.0～4.49 mm時，4個供試辣椒品種Pimiento、HXR-WU-02、豬大腸及Chile Guajillo中在單核靠邊期的小孢子比例最高，分別為62.15%，68.04%，74.4%，60.23%。依據花蕾長度與小孢子單核靠邊期比例的關系確定游離小孢子培養最佳時期所對應的選蕾標準。

關鍵詞：辣椒；小孢子；花蕾長度；發育時期

中圖分類號：S641.3 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.09.003

Relationgship between Length of Buds and Ratio of Uninucleate Microspore at Periphery in Capsicum annuum L.

HU Mei1， GAO Jie1， GE Ju-fen2， XU Jian1， ZHU Jun-fang1， WANG Na1

（1.College of Horticulture， Xinjiang Agricultural University， Urumqi， Xinjiang 830052，China； 2. Urumqi Institute of Vegetable，Urumqi， Xinjiang 830075 ，China）

Abstract： In order to improve the accuracy of drawing materials when chili pepper isolated microspore culture，using DAPI fluorescent staining to stain and observe four different varieties of chili pepper （Pimiento， HXR-WU-02， pig intestine and Chile Guajillo） and the five different length interval of chili pepper′s bud， the relationship between length of chili pepper′s bud and ratio of uninucleate microspore at periphery in chili pepper was studied. The results showed that differences existed between length of bud in different varieties of chili pepper and ratio of uninucleate microspore at periphery in chili pepper .When the bud length is in 4.0～4.49 mm， the proportion of Uninucleate microspore at periphery of four varieties tested is the highest， and the ration is 62.15%， 68.04%， 74.4% and 62.15%， respectively. So the relationship between length of chili pepper′s bud and ratio of uninucleate microspore at periphery in chili pepper can define the standard of bud selection in correspondence with the optimal stage of anther culture.

Key words： Capsicum annuum L.； microspore； development stage； flower bubs

辣椒（Capsicum annuum L.）是茄科辣椒屬一年生或多年生草本植物，原產地在美洲中部和南部的熱帶地區，在明末傳入我國，并被普遍種植，是人們廣為熟知的一種蔬菜，也是中國栽培面積最大的蔬菜作物之一[1-3]。辣椒屬常異花授粉植物[2]。由于雜種優勢十分明顯，雜交種一般比常規品種增加30%到50%的產量，同時抗病性、抗逆性提高和適應性增強[4]。因此，研究單倍體育種的工作具有重要意義。

花培和小孢子游離培養是誘導單倍體植株[5]的重要方法之一。國內辣椒花藥的培養始于1973年[6]。此后，許多學者對辣椒進行了大量的花藥培養試驗研究[7-8]，而今已成為獲取辣椒單倍體比較成熟的技術，在辣椒遺傳育種的工作中已被利用[9-10]。與花藥培養相比，游離小孢子培養可獲得純合單倍體植株，可避免花藥培養中母體組織帶來的雜合體[11]。因此，辣椒小孢子的發育在單倍體的誘導、遺傳物質的建立、品種的選育和栽培方法的制定方面具有重要的意義[12]。目前有關報道辣椒游離小孢子培養獲得植株成功的較少[13]，主要是因為技術體系的建立不完善，還不能應用于遺傳育種或基礎性研究[1]。但是，有研究表明花蕾的選取標準是游離小孢子培養的重要技術之一[14-15]，而花蕾取材時期的選擇又是影響胚胎發生效率的主要因素之一[16]，以往的辣椒游離小孢子培養試驗研究表明單核末期是最佳時間[17]。目前，在新疆還沒有辣椒小孢子培養研究的相關報道。本試驗對新疆及國外引進的辣椒品種花粉細胞的發育進行細胞學觀察，探討不同辣椒品種蕾長和其小孢子單核靠邊期比例之間的相關性，以期為辣椒游離小孢子培養選取花蕾提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試辣椒品種有Pimiento、Chile Guajillo、HXR-WU-02及新疆農家品種豬大腸。Pimiento，品種類型為櫻桃椒，來源墨西哥；Chile Guajillo，品種類型為線椒，來源墨西哥；HXR-WU-02，品種類型為線椒，來源荷蘭；豬大腸，品種類型為長角椒，來源天地和種業（新疆）。

1.2 方 法

1.2.1 植株培養 2014年5月1日，在新疆農業大學綜合實驗樓組培實驗室對辣椒種子進行溫湯浸種，然后催芽。5月5日在新疆農業大學實驗基地的簡易大棚內將辣椒播種于穴盤，6月11日定植移栽在新疆農業大學實驗基地，其后采取正常的田間管理。

1.2.2 不同長度區組的花蕾對應花粉細胞發育時期的觀察 植株初花期，在上午8：00到10：00時摘取不同長度的花蕾45～60個納入自封袋，放入冰盒帶回實驗室。然后使用游標卡尺量取花蕾長度，按花蕾不同長度分為5組，分別是2.00～2.99 mm、3.00～3.99 mm、4.00～4.49 mm、4.50～4.99 mm、5.0～5.99 mm。每一組分別選擇10～20個花蕾，先用2%的NaClO沖洗10 min，再用無菌水清洗3～4次。而后旋轉注射器活塞（必須用沒有黑色橡膠的一端）壓榨花蕾使其完全破碎，添加2 mL NLN培養基提取花粉小孢子，在冷凍離心機離心3次（150 s），轉速為6 000 r·min-1。將上清液倒掉，留下沉淀物。再用移液槍吸10 μL的DAPI染色液加入到沉淀里，放置黑暗處15 min后制備切片，而后將切片置于冰箱且在4 ℃條件下保存，且第2天將切片放置在熒光顯微鏡下觀察。

1.3 數據整理和分析

使用2003 Excel表格整理試驗數據，并使用DPS數據處理系統對試驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 辣椒花粉小孢子各發育時期的細胞學特征

熒光顯微鏡鏡檢觀察結果表明（如圖1），此4份辣椒品種Pimiento、HXR-WU-02、豬大腸及Chile Guajillo的花蕾長在2.00～2.99 mm時，花蕾中多數的花粉小孢子在單核早、中期，而少數的在四分體時期。四分體時期是花粉母細胞經由減數分裂產生的被一層厚的胼胝質包圍并呈對稱形排列在同一平面的四分小孢子，即四分體。單核早、中期的花粉小孢子體積變大，形成明顯的細胞壁，居于小孢子的中心含有一個較大的細胞核，細胞質中無顯著可見的液泡?；ɡ匍L為3.00～3.99 mm、4.00～4.49 mm時，花粉細胞內出現液泡，核從中心被擠壓到靠近細胞壁的邊緣，即單核晚期，萌發孔顯現?；ɡ匍L度在4.50～4.99 mm、5.00～5.99 mm時，單核靠邊期的花粉細胞體積持續增加，細胞呈正圓形，通過有絲分裂產生生殖核和營養核，此時為雙核期，前者較大且染色較深，后者較少且染色較淺。因此，通過對不同長度區組的花蕾中花粉小孢子發育各時期的細胞學特征的觀察和了解，且在不對花蕾進行染色試驗的情況下，可快速地判別出花蕾中花粉小孢子所處的發育階段。花粉小孢子的形態變為正圓狀，細胞核被擠壓靠近細胞壁和顯現萌發孔是小孢子單核靠邊期的主要識別特征。

2.2 不同品種辣椒花蕾的不同長度區組與單核靠邊期小孢子比例的關系

從表1可知，不同辣椒品種不同蕾長的單核靠邊期花粉小孢子比例有著顯著性差異。Pimiento、HXR-WU-02、豬大腸及Chile Guajillo此4個辣椒品種的花蕾長度在4.00～4.49 mm時與其它4個長度區組之間差異顯著，在該長度范圍內，4個辣椒品種的單核靠邊期的小孢子所占比例分別為62.15%，68.04%，74.4%及60.23%。HXR-WU-02該辣椒品種的花蕾長度在3.00～3.99 mm與4.50～4.99 mm和3.00～3.99與5.00～5.99 mm時，花蕾中單核靠邊期小孢子比例的差異性不顯著，且所對應的花粉小孢子的單核靠邊期比例在40%到10%之間。Chile Guajillo的花蕾長度在4.50～4.99與3.00～3.99 mm時沒有顯著的差異，而對應的花粉小孢子在單核靠邊期的比例皆在30%左右。而當花蕾長在2.00～2.99 mm時，此4個辣椒品種的比例皆為0。因此，可把蕾長作為后續的辣椒小孢子培養試驗研究中的采樣指標。

3 結論與討論

（1）經對花蕾進行DAPI染色后和在熒光顯微鏡下觀察發現：花粉小孢子的發育在同一長度區組的花蕾中是連續性的即不同步。辣椒花蕾長在2.00～2.99 mm、3.00～3.99 mm時，主要是單核早、中期花粉小孢子。但蕾長在2.00～2.99 mm時少數的小孢子處于四分體時期，而在3.00～3.99 mm時少量的花粉小孢子處于單核靠邊期?；ɡ匍L為4.00～4.49 mm時，處在單核晚期小孢子的比例超過60%，另外此時也尚有雙核花粉小孢子存在。當蕾長在4.50～5.99 mm時雙核花粉小孢子占絕大多數，單核晚期小孢子出現較少。

（2）本試驗采用的DAPI染色法相較于張祖姣等[12]和楊智博等[18]的石蠟切片法、張菊平等[16]和張天翔等[19]的醋酸洋紅染色法或PHCH染色法而言，具有操作簡單、省時省力、易于觀察等優點。以往的研究發現：小孢子的發育階段與辣椒花蕾的外部形態密切相關[18-20]。但是，本試驗主要觀察不同品種類型和長度的辣椒花蕾中花粉小孢子發育時期的細胞學特性，研究辣椒花蕾長度與其花粉細胞單核靠邊期所占比例之間存在的關系。

（3）辣椒蕾長與其單核晚期花粉小孢子比例之間的關系，可以視為小孢子是否適合誘導單倍體培養的指標。若按照辣椒花蕾的長度取材并應用于后期的游離小孢子培養研究中會很方便、快捷，且降低污染。本次試驗的結果是，4個供試辣椒品種Pimiento、HXR-WU-02、豬大腸及Chile Guajillo的蕾長為4.00～4.49 mm且花蕾發育正常，其小孢子的單核靠邊期比例分別為62.15%，68.04%，74.4%及60.23%。

參考文獻：

[1] 成妍，馬蓉麗，焦彥生，等.辣椒游離小孢子培養研究進展[J].山西農業科學，2012，40（3）：288-291.

[2] 張寶璽.我國辣椒生產和育種[J].辣椒雜志，2009（2）：8-9.

[3] Kothari S L， Joshi A， Kachhwaha S， et al. Chilli peppers are view on tissue culture and transgenesis[J].Biotechnol Adv，2010，28：35-48.

[4] 劉洪濤，劉新軍，辛華，等.辣椒保持系小孢子母細胞減數分裂的初步觀察[J].萊陽農學院學報，2005，22（3）：200-203.

[5] 王曉靜，梁燕.茄果類蔬菜小孢子培養研究進展[J].長江蔬菜：學術版，2010（4）：4-7.

[6] 王玉英，郭敬三，王敬駒.小黑麥和辣椒花粉植株的誘導[J].中國科學，1973（1）：104-105.

[7] Lantos C， Gemes A J， Somogyi G， et al. Improvement of isolated microspore culture of pepper （Capsicum annuum L.）viaco-culture with ovary tissues of pepper or wheat [J].Plant Cell Tissue Organ Cult，2009，97：285-293.

[8] Santana-Buzzy N， Canto-Flick A， Iglesias-Andreu L G， et al. Improvement of in vitro culturing of Habanero pepper by inhibition of ethylene effects[J].Hort Science，2006，41：405-409.

[9] 邢永萍，張樹根，張軍民，等.保護地甜椒新品種海豐26號選育初報[J].辣椒雜志，2003（3）：22-23.

[10] Bal U， Abak K. Haploidy in tomato （Lycopersicon esculentum Mill.）：A critical review[J].Euphytica，2007，158：1-9.

[11] 劉怡斐，劉廣夏，王吉慶，等.辣椒小孢子培養研究進展[J].河南農業科學，2008（10）：19-23.

[12] 張祖姣，楊博智，周書棟，等.辣椒小孢子發育的細胞學觀察[J].辣椒雜志，2009（1）：38-41.

[13] 王燁.辣椒游離小孢子培養及其顯微觀察[D].北京：中國農業科學院，2004.

[14] 星曉蓉.白菜型油菜小孢子培養成胚率及植株再生的影響因素[J].西北農業學報，2011，20（7）：94-97.

[15] Pankaj B， Joan D， Patricia P， et al. A high throughput Brassica napus microspore culture system： Influence of percoll gradient separation and bud selection on embryogenesis[J].Plant Cell Tiss Organ Cult，2011（106）：359-362.

[16] 張菊平，鞏振輝，劉克珂，等.辣椒小孢子發育時期與花器形態的相關性[J].西北農林科技大學學報：自然科學版，2007，35（3）：153-158.

[17] 王玉英，郭仲琛，李春玲，等.甜椒花藥培養的初步研究[J].園藝學報，1980，7（1）：37-39.

[18] 楊博智，周書棟，張祖姣，等.辣椒小孢子發育時期與花器形態特征相關性分析[J].湖南農業科學，2013（3）：1-3，7.

[19] 張天翔，林宗鏗，楊俊杰，等. 甜椒小孢子發育的細胞學觀察[J].中國農學通報，2013，29（1）：103-106.

[20] 賈展慧，趙尊練，許蒙，等.線辣椒小孢子發育時期與花蕾形態的相關性研究[J].辣椒雜志，2011（2）：24-27.