豬圓環病毒2型分子生物學研究進展

李富強　王利麗　李秀麗

摘 要：豬圓環病毒 2 型 （PCV2）是引起豬圓環病毒相關疾病 （PCVAD） 的主要病因。目前流行的 PCV2 被分為PCV2a 和 PCV2b 兩個亞群。北美和其他國家 PCVAD 的暴發通常與主要基因型從PCV2a轉變為PCV2b 有關。本文對圓環病毒2型的分子結構及其表達產物的生物學活性的研究進展進行了綜述，最后對分子差異和致病性進行了討論。

關鍵詞：豬圓環病毒2型；分子結構；致病性；

中圖分類號：S852.65 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.09.013

Progress on Molecular Biology of PCV2

LI Fu-qiang，WANG Li-li， LI Xiu-li

（Tianjin Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Tianjin 300384，China）

Abstract：Porcine circovirus type 2 （PCV2） was the main cause of porcine circovirus virus associated disease （PCVAD）.PCV2a and PCV2b，two subgroups of PCV2，were epidemic recently. In North America and other countries ，PCVAD outbreaks were usually related to main genotype from PCV2a into PCV2b.In this paper， the molecular structure of the porcine circovirus virus type 2 and the research progress of its expression product biological activities were summarized， and finally discussed the relation of molecular differences and pathogenicity were discussed.

Key words： porcine circovirus type 2； molecular structure； pathogenicity

20世紀70年代，Tischer等報道PK-15（ATCC-CCL3）細胞系受到某種病毒污染，生化分析表明該病毒基因組為環狀單鏈DNA，故命名為豬圓環病毒。早期試驗性感染表明，PK-15感染病毒后沒有引發具有臨床癥狀的疾病。直到20世紀90年代，加拿大出現一種名為PMWS的新型衰竭性疾病。利用PCV特異性單克隆抗體進行電鏡和免疫組化試驗，證實感染豬的組織中存在圓環病毒。經PCR擴增后分析序列，發現該病毒與早期感染PK-15細胞系的病毒約有70%的相似性，因此人們用PCV1和PCV2來區別PK-15細胞系污染病毒和PMWS病例分離株。

1 病毒結構及病原生物學特性

豬圓環病毒2型屬于圓環病毒科圓環病毒屬，單股負鏈環狀不分節無囊膜DNA病毒。基因組全長約1 767～1 768 bp，衣殼蛋白呈二十面體對稱[1]。

對于PCV2的生物學特性和理化特性與PCV1相似。與福爾馬林、酒精、碘酒和雙氯苯雙胍己烷室溫下作用10 min，病毒滴度會下降。對苯酚、季胺類化合物、氫氧化合物等較敏感[2]，不凝集人、猴、豬、兔、小鼠及雞的紅細胞[3]。PCV2體外培養不能在豬胎腎原代細胞、恒河猴腎細胞、BHK-21細胞上生長，可在PK-15細胞中生長但不引起細胞病變。自然宿主為家豬和野豬，豬科以外動物不易感染PCV2。傳播途徑主要為接觸感染，感染動物的糞便、尿液、唾液及精液均含有病毒[4]。

2 基因結構及病毒蛋白生物學活性

PCV2基因組由11個開放閱讀框（ORFs）組成，其中ORF1和ORF2為兩個主要閱讀框。目前的研究主要集中在ORF1，ORF2，ORF3，ORF4和ORF5 五個閱讀框。

ORF1靠近PCV2基因組起始位點，位于正鏈方向，ORF1基因全長945 nt，編碼314個氨基酸，翻譯成復制酶蛋白Rep和Rep。Rep由整個ORF1翻譯而成。分子質量36 ku，含3個N -糖基化位點。研究表明，位于蛋白23-25位aa（NPS）、256-258aa（NQT）的N-糖基化位點發生突變能夠降低病毒復制，286-288aa（DAT）的N-糖基化位點發生突變能夠促進病毒復制[5]。Rep蛋白含有3個保守基列，是典型滾環復制相關位點。此外，還有一個莖-環結構區[6]。Rep由ORF1轉錄子在mRNA第417～799處的剪切位點剪接而成，含有178個氨基酸，分子質量為20.4 ku。RepC端的68個氨基酸來自不同的ORFs[7]。PCV2病毒的復制需要Rep和Rep蛋白互相作用共同啟動，結合位點位于ORF1和ORF2之間的莖-環結構區[8]。

ORF2位于反義鏈方向，編碼233或234個氨基酸的病毒衣殼蛋白（CP），亦稱為結構蛋白（Cap）。CP上面存在著病毒的主要抗原決定簇，是PCV2病毒與細胞受體黏附的主要區域，也是研制PCV2病毒疫苗的首選區域。Cap蛋白N端1-41位為核定位信號肽序列，其中第12～18位和第34～41位氨基酸對Cap蛋白在細胞核的定位過程中起重要作用[9]。第65～87位，113～139位，163～183位，193～207位氨基酸4個區域與抗原免疫反應相關[10]。

Khayat等[11]進一步研究發現70位ASP、71位Met、77位Asn和78位Asp是第65～87位抗原免疫反應相關區域的關鍵殘基；113位Glu、115位Asp和127位Asp是113～139位抗體免疫反應相關區域的抗體識別的重要位點；203位Glu、206位Ile和207位Tyr是193～207位區域的抗體識別位點。Trible等[12]鑒定了163～183位區域的與疾病相關的免疫功能表位，丙氨酸掃描發現Y-173、F-174、Q-175和K-179是重要的抗體識別位點。

ORF3重疊于ORF1負鏈內，編碼105個氨基酸，方向與ORF2相同。Liu等[13]通過檢測ORF3功能缺失病毒在PK-15細胞內的復制拷貝發現ORF3不參與病毒復制，但是參與激活caspase-8和caspase-3途徑，在介導細胞凋亡中有重要作用。研究表明ORF3蛋白同Pirh2相互作用能夠使腫瘤抑制因子p53蛋白的表達量升高，進而誘導細胞凋亡[14-15]。Liu[16]進一步試驗發現，ORF3蛋白功能缺失體無法造成小鼠的微觀病變，并且對CD4和CD8、CD8細胞的弱化功能減弱。同時ORF3蛋白免疫小鼠后血清中IL-4的質量濃度顯著升高，IL-10、IL-12、IFN-gamma的質量濃度沒有明顯變化，說明ORF3蛋白在PCV2誘發的體液免疫中發揮著一定的作用[17]。

ORF4重疊于ORF3內，全長約180 bp，轉錄方向與ORF3相同但采用不同起始密碼子[18]。李增魁等[19]體外表達ORF4蛋白發現其有一定的細胞毒性。He等[20]構建拯救出了PCV2-ORF4缺失體病毒（PCV2△），并和野生型病毒（wPCV2）分別感染細胞和小鼠。結果表明，PCV2△感染細胞后能夠提高caspase-3、8、9的活性，證明ORF4與凋亡抑制相關。PCV2△感染的小鼠體內出現CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD8+T淋巴細胞嚴重減少，說明PCV2△比wPCV2具有更強的致病力，表示ORF4基因是PCV2致病的負調控基因。

ORF5基因全長180 nt，與ORF1轉錄方向相同。Lv等[21]對PCV2bORF5基因進行定點突變，發現其與病毒復制和細胞凋亡無關。通過構建真核表達載體表達ORF5基因蛋白研究其生物功能顯示，綠色熒光蛋白（GFP）標記的ORF5蛋白集中于細胞內質網上，具有減弱蛋白酶體，延長細胞周期S期，抑制肺泡巨噬細胞生長的作用。

進一步研究發現ORF5能誘導內質網活化NF-КB信號，上調IL-6、IL-8和COX-2的表達。細胞蛋白GPNMB、CYP1A1、YNHAB、ZNF511和SRSF3通過酵母雙雜交系統（yeast two-hybrid assay）與ORF5蛋白相互作用。

3 基因亞型分類

國際病毒分類學委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses ，ICTV）對種以下不進行分類，Grau-Roma等[22]基于不同PCV2全基因組序列錯配比率（即遺傳距離P）提出了一種PCV2全基因組分型方法，即當遺傳距離p超過0.02時，認定為不同亞型。這種方法在病毒學上已經被廣大學者廣泛接受。Segalés等[23]對196份PCV2 ORF2序列的錯配比率與其頻率構建直方圖發現，在不同遺傳距離處有兩個頻率高峰，兩個頻率高峰之間，位于p=0.035處有一處頻率低谷。因此，PCV2 ORF2序列的遺傳距離超過0.035時即判定為不同基因亞型。應用這兩種方法對GeneBank上的序列進行分析，均能得到3種相同的基因亞型。對于Wang等[24]對中國分離株進行系統發生樹分析時，并沒有應用以上兩種方法，Cortey等[25]對Wang提交的序列比對后認為Wang提出的新的基因型PCV2d和PCV2e的命名不成立，它們應分別屬于PCV2b和PCV2a兩種亞型。Olvera等[26]按照上述方法將PCV2a細分為5個進化枝（p=0.015 8），命名為PCV群II A-E，PCV2b細分為3個進化枝（p=0.023 4），命名為PCV群I A-C。

4 分子差異與致病力

PCV2a基因組全長1 768 bp，PCV2b基因組全長1 767 bp，在核苷酸水平上有95%相同。PCV2a在1 487～1 473位為ACCAACAAAAT，PCV2b在1 486～1 472位為TCAAACCCCCG。氨基酸序列為86-TNKISI和86-SNPRSV[27]。目前尚無報道表明該段序列差異與病毒致病性或毒力相關。

PCV2a和PCV2b在全球范圍內存在，2000年以前PCV2a為主要的致病基因亞型，2000年以后轉變為PCV2b。但研究表明，單一的PCV2a或單一的PCV2b病毒在試驗動物上不能很好的復制出相應的PWMS，需要與PRRSV等其他病原微生物混合感染才能達到預期效果。Cortey等[28]對西班牙PCV2a和PCV2b的歷年檢測頻率進行了統計，認為PCVAD的爆發與PCV2a到PCV2b的基因亞型轉化有關。Harding等[29]試驗性的將PCV2a和PCV2b兩兩排列組合，按攻毒順序分成2a/2a、2a/2b、2b/2a、2b/2b 4組，分別感染SPF豬，兩次攻毒間隔一周，發現PCV2a和PCV2b無論以何種順序組合都能復制出PCVAD。Khaiseb等[30]對發病和亞臨床狀態豬的組織進行原位雜交試驗，發現發病豬的組織表現為細胞同時感染兩種基因亞型；亞臨床狀態豬僅感染一種基因亞型，這進一步證明了PCV2a和PCV2b相互作用能夠促進疾病的發生和發展。

5 展 望

豬圓環病毒的發現與發展僅僅幾十年的時間，但已經成為世界范圍內廣泛存在的疾病。由于常見持續性消瘦、衰竭而亡，病程較長，只是偶然出現大規模爆發大量死亡的情況，因此，飼養管理人員及部分科研人員對該病不予重視。這不僅造成了大量的經濟損失，養殖成本增高，也造成了PCV2病毒的傳播與變異。現階段對于PCV2的各開放閱讀框的功能還未完全明了，致病機理和逃脫免疫的機制目前尚存爭議，因此，對于PCV2基因各開放閱讀框功能的研究可能對闡述PCV2的致病機理和免疫逃脫機制提供依據。

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