米曲霉固態(tài)發(fā)酵三七渣產(chǎn)淀粉酶的研究

王 浪， 譚顯東， 胡 偉， 羊依金

（成都信息工程大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，四川成都610225）

三七渣是三七提取皂苷后的廢棄物，目前主要采用露天堆放、焚燒或填埋的方式進(jìn)行處置，不僅造成了大量生物質(zhì)資源的浪費(fèi)，還會(huì)帶來(lái)二次污染。研究表明，三七渣中富含淀粉、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸、維生素、微量元素等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及三七多糖等生物活性成分（楊智等，1994）。采用三七渣替代常規(guī)飼料原料作為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基使用，可以降低生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)其資源化利用。三七渣經(jīng)米曲霉發(fā)酵后所得的發(fā)酵培養(yǎng)物中含有大量的淀粉酶，可以作為飼料添加劑使用。本研究采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)米曲霉固態(tài)發(fā)酵三七渣產(chǎn)淀粉酶的工藝條件進(jìn)行了研究和優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 米曲霉（Aspergillus oryzae），由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院保藏與提供。

1.1.2 三七渣 三七渣，由四川省某中成藥集團(tuán)提供，經(jīng)自然風(fēng)干、烘干、粉碎、過篩后，置于干燥器中備用。其組成成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為：粗淀粉33.13%，粗蛋白質(zhì)12.28%，真蛋白質(zhì)9.97%，還原糖1.37%。

1.1.3 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯浸取液1000mL，葡萄糖20.0 g，瓊脂15.0 g，pH值自然，121℃滅菌30 min，用于米曲霉的培養(yǎng)和種子液的制備。

三七渣培養(yǎng)基：過60目篩的三七渣10 g，培養(yǎng)基含水率為65%，初始pH自然，培養(yǎng)基于121℃滅菌30 min，用于米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)淀粉酶的研究。除特殊說(shuō)明外，本試驗(yàn)所用培養(yǎng)基組成均為此。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備 將在PDA上培養(yǎng)3 d的米曲霉菌種，用滅過菌的無(wú)菌水沖洗，制備孢子懸浮液，制備的菌懸液濃度為2×107個(gè)/mL。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 除特殊說(shuō)明外，米曲霉發(fā)酵培養(yǎng)過程如下：在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，接入10%的米曲霉孢子菌懸浮液 （即在10.0 g三七渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中接入1 mL菌懸浮液，即為10%的接種量，下同），將其置于PYX-280M-C霉菌培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間為5 d。

1.2.3 酶液的制備 稱取1.000 g發(fā)酵培養(yǎng)物（濕物料）于錐形瓶中，加入50 mL蒸餾水并充分?jǐn)嚢枋蛊渚鶆驊腋。賹⑵浞湃?0℃的恒溫水浴鍋中浸提60 min后，用8層紗布過濾上述提取液，再將濾液經(jīng)5000 r/min離心10 min后取其上清液置于4℃下保存，備用。

1.2.4 淀粉酶活的測(cè)定 淀粉酶活的測(cè)定參照芶琳和單志（2010）的方法。

酶活單位定義為：在試驗(yàn)條件下，5 min內(nèi)降解1 mg/mL的淀粉溶液生成1 μmol還原糖需要的酶量，定義為1個(gè)酶活單位，記為U/g濕物料。

1.2.5 單因素試驗(yàn) 分別考察氮源添加量、初始含水量、培養(yǎng)時(shí)間、三七渣粒徑對(duì)產(chǎn)淀粉酶的影響。

1.2.6 正交試驗(yàn) 選取培養(yǎng)時(shí)間、三七渣粒徑和含水率3個(gè)因素，進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)。

本次研究中每個(gè)試驗(yàn)結(jié)果均為3個(gè)平行試驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 硫酸銨添加量對(duì)產(chǎn)淀粉酶的影響 在三七渣基質(zhì)中按照一定比例（0%～5%）添加硫酸銨，考察氮源添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 硫酸銨添加量對(duì)產(chǎn)淀粉酶的影響

由圖1可見，不添加硫酸銨時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)物的淀粉酶活最高，隨著硫酸銨添加量的增加，淀粉酶活反而逐漸減小，最終趨于平穩(wěn)，這說(shuō)明三七渣中主要營(yíng)養(yǎng)成分比較均衡，其碳氮比合適淀粉酶的生產(chǎn)。Swetha等（2007）采用米曲霉固態(tài)發(fā)酵工農(nóng)業(yè)廢料產(chǎn)淀粉酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加氮源并未促進(jìn)淀粉酶的增加，與本試驗(yàn)結(jié)果類似。但胡偉等（2013）卻發(fā)現(xiàn)采用黑曲霉發(fā)酵三七渣產(chǎn)淀粉酶，適量添加氮源（40～60 mg硫酸銨/g干藥渣）有利于淀粉酶的生產(chǎn)。

2.1.2 三七渣粒徑對(duì)產(chǎn)淀粉酶的影響 分別采用過 20、40、60、80、100、120 目篩的三七渣作為發(fā)酵基質(zhì)，考察三七渣粒徑對(duì)產(chǎn)淀粉酶的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 三七渣粒徑對(duì)產(chǎn)淀粉酶的影響

從圖2可見，采用過80目篩的三七渣作為發(fā)酵基質(zhì)，發(fā)酵培養(yǎng)物的淀粉酶活最高。基質(zhì)顆粒過大或過小都會(huì)影響產(chǎn)酶：小的物料顆粒可以提供較大的微生物生長(zhǎng)面積，從而提高反應(yīng)速率，但是顆粒太小又容易導(dǎo)致物料結(jié)塊和孔隙率降低，增大傳熱和傳質(zhì)阻力，影響微生物的呼吸，進(jìn)而影響微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)酶；大顆粒物料由于存在較大的孔隙率有利于提高傳質(zhì)、傳熱效率，但是只能提供較小的微生物生長(zhǎng)面積 （Krishna和Chandrasekaran，1996；Frantisek 和 Anil，1995）。

2.1.3 含水率對(duì)產(chǎn)淀粉酶的影響 初始含水率對(duì)于微生物的增殖和酶的產(chǎn)生是一個(gè)重要的因素，含水率過高或者過低都會(huì)影響固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶量（Pengthamkeerati等，2012）。 含水率過低，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶解與傳輸；含水率過高，則易使物料結(jié)塊，阻礙氣體和熱量的擴(kuò)散和傳輸，都不利于菌體的生長(zhǎng)（張福元和陳風(fēng)風(fēng)，2008）。本次研究考察了培養(yǎng)基初始含水率為50%～75%時(shí)對(duì)產(chǎn)淀粉酶的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 含水率對(duì)產(chǎn)淀粉酶的影響

由圖3可見，當(dāng)培養(yǎng)基的初始含水率為50%～65%時(shí)，淀粉酶活隨初始含水率的增大而增大。當(dāng)初始含水率達(dá)到65%時(shí)，淀粉酶活達(dá)到最大（114.4 U/g），此后隨著含水率的增加，酶活逐漸下降。采用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵三七渣時(shí)，在水含量為55%時(shí)，淀粉酶活力就能達(dá)到最高 （胡偉等，2013），而 Suhad 等（2011）研究表明固體基質(zhì)的含水率為40%～70%時(shí)有利于米曲霉產(chǎn)淀粉酶，這說(shuō)明不同的基質(zhì)和微生物對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基初始含水率的要求是有差別的。

2.1.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)淀粉酶的影響 從圖4可以看出，發(fā)酵培養(yǎng)3 d后淀粉酶活達(dá)到最高（113.94 U/g），之后酶活又有所下降，其酶活達(dá)到峰值的時(shí)間比采用黑曲霉單菌或黑曲霉/產(chǎn)朊假絲酵母混菌發(fā)酵三七渣時(shí)提前了很多，后兩者淀粉酶活達(dá)到峰值的時(shí)間分別為168 h和216 h（譚顯東等，2014；胡偉等，2013）；而采用麥麩或木薯渣和生物污泥的混合物作為培養(yǎng)基質(zhì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)淀粉酶的最適培養(yǎng)時(shí)間分別為5 d和2 d（Farid和Shata，2011；Pengthamkeerati等，2012）。 這也說(shuō)明，發(fā)酵基質(zhì)和微生物的種類對(duì)淀粉酶活到達(dá)峰值的時(shí)間影響較大。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)淀粉酶的影響

2.2 正交試驗(yàn) 為了獲得最優(yōu)的培養(yǎng)工藝條件，本次研究采用L9（33）正交試驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)條件的優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素與水平見表1，試驗(yàn)結(jié)果與方差分析分別見表2和表3。

由表3可以看出，含水率、粒徑、培養(yǎng)時(shí)間以及三者之間的交互作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響均極顯著（P＜0.01），這三個(gè)因素以及它們之間的交互作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響程度的排序?yàn)椋号囵B(yǎng)時(shí)間＞含水率＞粒徑＞交互作用。由于所考察的三個(gè)因素之間的交互作用顯著，因而需進(jìn)行多重比較才能獲得最優(yōu)試驗(yàn)條件組合。多重分析結(jié)果見表4。

表1 因素與水平

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)多重比較結(jié)果

由表4可以看出，試驗(yàn)1和試驗(yàn)6的結(jié)果最優(yōu)，兩者之間無(wú)顯著差異，考慮到生產(chǎn)成本，較優(yōu)的工藝條件搭配為試驗(yàn)1（A1B1C1）。在此條件下，米曲霉固態(tài)發(fā)酵三七渣所得發(fā)酵培養(yǎng)物中淀粉酶活為125.00 U/g濕物料，優(yōu)于黑曲霉發(fā)酵的結(jié)果（胡偉等，2013）。

3 結(jié)論

3.1 含水率、粒徑、培養(yǎng)時(shí)間以及三者之間的交互作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響均極顯著 （P＜0.01），這三個(gè)因素以及它們之間的交互作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響程度的排序?yàn)椋号囵B(yǎng)時(shí)間＞含水率＞粒徑＞交互作用。

3.2 在優(yōu)化的工藝條件下，即采用過60目篩的三七渣，培養(yǎng)基初始含水率60%，培養(yǎng)時(shí)間2 d，接種量10%，米曲霉固態(tài)發(fā)酵三七渣所得發(fā)酵培養(yǎng)物中淀粉酶活為125.00 U/g濕物料。

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