44個紫花苜蓿品種的酸鋁適應(yīng)性與耐受性評價

田政，楊正禹，陸忠杰，羅奔，張茂，董瑞

（貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

目前，全世界約有30%耕地是酸性土壤，全球范圍內(nèi)有20%的玉米（Zea mays）、13%的水稻（Oryza sativa）生長在該區(qū)域，嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)［1］。我國酸性土壤總面積達(dá)203 萬hm2，分布遍及南方15 個省區(qū)［2］。鋁（Al）是土壤中含量最多的金屬元素，其在地殼中平均含量約為8%［3］。鋁毒害被認(rèn)為是酸性土壤中限制植物生長發(fā)育的主要因素。土壤中鋁的存在與土壤的酸堿度密切相關(guān)，當(dāng)土壤pH 值低于5.5時，土壤中會溶出更多的［Al（H2O）6］3+或Al3+，影響植物的生長發(fā)育［4］。土壤酸鋁脅迫對植物的毒害癥狀主要表現(xiàn)為：主根伸長受到抑制，根尖、側(cè)根粗短且脆弱易斷，根冠脫落，根毛減少甚至消失，根尖表皮和外皮層細(xì)胞受到破壞等［5-6］。

紫花苜蓿（Medicago sativa）被譽(yù)為“牧草之王”，是世界上栽培面積最廣的牧草，1999-2000年全世界種植面積3200 萬～3227 萬hm2［7］，我國種植面積約為135 萬hm2［8］。紫花苜蓿最適生長pH 為6.7～7.5，對酸性土壤中活性鋁極度敏感，高于0.1 mmol·L-1的鋁脅迫即可顯著抑制其發(fā)芽和生長［9］。任曉燕［10］發(fā)現(xiàn)鋁脅迫下紫花苜蓿幼苗的生長會受到抑制，根長、根系活力、地上生物量和地下生物量顯著降低。姜娜等［11］發(fā)現(xiàn)鋁對紫花苜蓿生長具有明顯的抑制作用，同時Al 處理下苜蓿會積累大量有機(jī)酸，而且不同紫花苜蓿品種間差異較大。對于鋁離子是如何激活植物中有機(jī)酸分泌，Ma 等［12］提出小麥（Triticum aestivum）和玉米有機(jī)酸陰離子的運(yùn)輸是通過質(zhì)膜中鋁激活的陰離子通道介導(dǎo)的，在葉子中積累鋁的植物，通過與有機(jī)酸形成復(fù)合物，從內(nèi)部對鋁進(jìn)行解毒。Barone等［13］研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸合酶表達(dá)可能利于紫花苜蓿的耐鋁性。Sun 等［14］研究指出苜蓿品種對鋁的抗性表現(xiàn)出多樣性，敏感型的紫花苜蓿的根尖分泌檸檬酸和蘋果酸較少，而抗鋁品種會分泌較多的檸檬酸和蘋果酸。目前，植物根系有機(jī)酸的分泌被認(rèn)為是植物抵御酸鋁脅迫最重要的機(jī)制之一。但這些研究多集中于小麥、玉米、水稻等糧食作物，對紫花苜蓿研究較少，關(guān)于鋁毒如何對紫花苜蓿有機(jī)酸代謝產(chǎn)生影響的機(jī)理仍不清楚。

因此，本研究以44 份紫花苜蓿品種為研究對象，對兩個地點紫花苜蓿產(chǎn)量進(jìn)行分析，篩選出敏感型和耐受型品種，并以之為材料進(jìn)行酸鋁脅迫試驗，測定其在脅迫前后的電導(dǎo)率、存活率、根系鋁含量及有機(jī)酸含量，以期為紫花苜蓿在南方酸性土壤條件下推廣提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和育種材料。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

貴州省貴陽市花溪區(qū)貴州大學(xué)試驗地（106°07′E，26°11′N，海拔1100 m），位于貴州高原中部，屬于亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候，具有明顯的高原氣候特點。年平均氣溫14.8 ℃，年均降水量1347.3 mm（數(shù)據(jù)來源于中國氣象網(wǎng)）。試驗地前期未種植農(nóng)作物，主要以自然野生雜草為主。

貴州省銅仁市石阡縣花橋鎮(zhèn)北坪村試驗地（108°20′14″E，27°32′03″N，海拔614 m），位于貴州省東部，屬于中亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候，日照充足，雨量豐沛，年平均氣溫17.24 ℃，年均降水量1410.05 mm。試驗地前茬作物為玉米。

分別在上述兩個試驗地開展試驗，兩個試驗地均未種植過苜蓿屬植物。收集兩個試驗地地表約20 cm 的土壤，去除小石塊及其他雜物，烘干后磨碎過2 mm 篩，測定其土壤基礎(chǔ)營養(yǎng)組成成分和pH（表1）。

表1 兩個研究區(qū)土壤營養(yǎng)組成成分和pH 值Table 1 Soil physical and chemical properties in the two study areas

1.2 供試苜蓿品種

供試苜蓿品種分國內(nèi)品種21 份，國外品種23 份，由蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院王彥榮教授團(tuán)隊提供，詳見表2。

表2 紫花苜蓿品種信息Table 2 Alfalfa species information

1.3 試驗方法

1.3.1 田間試驗 兩個地點均于2018年10 月種植紫花苜蓿，均采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，兩個試驗點各品種均種植10 個單株，株行距均為50 cm，3 次重復(fù)。期間定期除草，不進(jìn)行施肥和人工灌溉處理。于2020年刈割取樣，刈割時期均為初花期，測量每次刈割的干重產(chǎn)量以及紫花苜蓿刈割一年的總干重。測量：各品種隨機(jī)選取3 株刈割，將刈割的苜蓿植株105 ℃殺青，65 ℃烘干至恒重，電子天平稱重。

使用GenStat 7.1（2003）中基因與環(huán)境互作GGE 模型對兩個試驗點測量的44 份紫花苜蓿性狀進(jìn)行綜合分析，得到44 份紫花苜蓿的綜合排名。

1.3.2 酸鋁脅迫試驗 材料為田間試驗篩選到的耐受型品種阿爾岡金和敏感型品種UC-1465。種子使用1.0%（v/v）次氯酸鈉滅菌5 min，蒸餾水沖洗5 次，25 ℃黑暗條件萌發(fā)3 d。待幼苗長至三葉期時，挑選長勢一致的幼苗，將其種植在裝有混合土壤（珍珠巖∶蛭石∶泥炭=1∶1∶2，v/v）的托盤中生長一個月，16 h/8 h（光/暗）。接著移到帶有漂浮板的Hoagland 營養(yǎng)液（pH 5.8）中，在25 ℃下生長兩周后，將幼苗移入不含AlCl3的0.5 mmol·L-1CaCl2Hoagland 營養(yǎng)液（pH 4.3）中預(yù)處理12 h，隨后將預(yù)處理后的幼苗移入含有50 μmol·L-1AlCl3的0.5 mmol·L-1CaCl2Hoagland 營養(yǎng)液（pH 4.3）中做鋁脅迫處理，對照組是不含AlCl3的0.5 mmol·L-1CaCl2Hoagland營養(yǎng)液（pH 4.3），用于后續(xù)根尖結(jié)構(gòu)觀察，細(xì)胞活力、鋁含量、有機(jī)酸含量測定。

1.3.3 電導(dǎo)率與存活率 將托盤中生長2 周的紫花苜蓿幼苗浸入不含AlCl3和含有1 mmol·L-1AlCl3（pH 4.3）的0.5 mmol·L-1CaCl2Hoagland 營養(yǎng)液中。每組50 株，重復(fù)3 次，連續(xù)處理6 周后計算存活率。電導(dǎo)率采用抽氣法測量，參照陳愛葵等［15］的做法，取葉片用蒸餾水沖洗干凈并擦干，將葉片切割成大小相同的葉塊，稱取0.1 g 于裝有6 mL 去離子水的注射器中，不斷抽提至葉片完全沉入水底，葉片在去離子水中處理3 h 后測定浸提液電導(dǎo)率（R1），然后金屬浴加熱30 min，冷卻至室溫后搖勻，再次測定浸提液電導(dǎo)率（R2），重復(fù)3 次。

1.3.4 根尖細(xì)胞活力及結(jié)構(gòu) 脅迫處理8 h 后，收集幼苗根尖并用去離子水沖洗干凈，將一部分清洗干凈的幼苗根尖用2 μg·mL-1的FDA 溶液染色10 min，染好色的幼苗根尖用去離子水清洗附著染料，用帶有熒光裝置的立體顯微鏡（Axio Zoom.V16，德國）觀察幼苗根尖熒光強(qiáng)度。另一部分清洗干凈的幼苗根尖放入FAA 固定液（濃度為45%無水乙醇，6%乙酸，5%甲醛）中固定，做石蠟切片，觀察根尖橫截面結(jié)構(gòu)。

1.3.5 根系鋁含量測定 脅迫處理72 h 時，將處理后的幼苗用去離子水將根沖洗干凈后，根據(jù)原子吸收法［16］并利用原子吸收光譜儀（4510F，上海）分析根系A(chǔ)l3+含量。

1.3.6 根系有機(jī)酸含量測定 分別取脅迫前和脅迫24 h 后各0.2 g 根尖用1 mL 0.5 mol·L-1HCl 研磨并取勻漿，將勻漿液在80 ℃下加熱20 min，偶爾搖動，冷卻后12000 r·min-1離心10 min。取上清液過0.22 μmol·L-1過濾器，采用高效液相色譜儀（HPLC，1200 Infinity LC，Agilent，美國）分析有機(jī)酸濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應(yīng)用Excel 2013 對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和圖表制作，應(yīng)用SPSS 20.0 進(jìn)行單因素ANOVA 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 44 份紫花苜蓿品種產(chǎn)量分析

由表3 可知，2020年在貴陽研究區(qū)干草產(chǎn)量最高的5 個苜蓿品種為WL363HQ、阿爾岡金、WL354HQ、Boja 、Trifecta，總干重分別為653.38、564.15、544.17、542.40、522.56 g；干草產(chǎn)量最差的5 個品種為UC-1465、Orca、隴東苜蓿、三得利、中蘭1 號苜蓿，總干重分別為84.31、153.22、173.73、190.76、192.54 g。在石阡研究區(qū)干草產(chǎn)量最高的5 個苜蓿品種為阿爾岡金、Trifecta、新疆大葉苜蓿、中牧1 號苜蓿、Vernal，總干重分別為464.91、429.94、378.21、351.74、350.40 g；干草產(chǎn)量最差的5 個品種為UC-1465、隴中苜蓿、CUF 101、中苜1 號苜蓿、隴東苜蓿，總干重分別為150.97、161.55、162.25、167.90、168.28 g。在兩個研究區(qū)產(chǎn)量最高的5 個品種與最低的5 個品種之間均達(dá)到顯著（P＜0.05）差異。

表3 44 份紫花苜蓿品種干重方差分析Table 3 Analysis of variance of dry weight of 44 alfalfa varieties（g·plant-1·a-1）

2.2 44 份紫花苜蓿綜合性評價

利用基因與環(huán)境互作GGE 模型對貴陽試驗地與石阡試驗地收獲的44 份紫花苜蓿總干重性狀進(jìn)行分析，排名前五的分別為阿爾岡金、新疆大葉苜蓿、Trifecta、Vernal、中牧1 號苜蓿，后五名分別為隴中苜蓿、東苜1 號苜蓿、隴東苜蓿、CUF 101、UC-1465（表4）。根據(jù)綜合分析結(jié)果，選擇阿爾岡金作為酸鋁脅迫耐受型品種，UC-1465 為酸鋁脅迫敏感型品種開展后續(xù)試驗。

表4 44 份紫花苜蓿田間試驗綜合排名Table 4 Comprehensive ranking of 44 alfalfa field trials

2.3 電導(dǎo)率與存活率分析

經(jīng)AlCl3連續(xù)處理六周后UC-1465 電導(dǎo)率顯著（P＜0.05）高于阿爾岡金，分別為468.0 和253.5 mS·cm-1。對照組中的阿爾岡金和UC-1465 的存活率分別為92%和88%，經(jīng)過AlCl3處理后的阿爾岡金存活率可達(dá)64%，UC-1465 的存活率僅為10%，阿爾岡金的存活率顯著（P＜0.05）高于UC-1465（圖1）。

圖1 鋁脅迫對紫花苜蓿相對電導(dǎo)率和存活率的影響Fig.1 Effect of Al stress on the relative conductivity and survival rate of alfalfa大寫字母代表不同鋁濃度脅迫間的差異性（P＜0.05）；小寫字母代表不同品種間的差異性（P＜0.05）。下同。The capital letters represent the differences（P＜0.05）among different aluminum concentration stress；The lowercase letters represent the differences（P＜0.05）among different varieties.The same below.

2.4 根尖細(xì)胞活力及結(jié)構(gòu)

未經(jīng)脅迫的阿爾岡金和UC-1465 根尖熒光均較強(qiáng)，脅迫后兩者根尖熒光強(qiáng)度均降低，且UC-1465 的根尖熒光強(qiáng)度弱于阿爾岡金（圖2Ⅰ）。未經(jīng)脅迫的兩個品種根尖表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，無細(xì)胞增大及破損現(xiàn)象，脅迫后阿爾岡金根尖表皮細(xì)胞較完整，細(xì)胞壁較對照出現(xiàn)增厚；UC-1465 根尖表皮細(xì)胞破損，細(xì)胞增大（圖2Ⅱ）。

圖2 紫花苜蓿鋁脅迫前后根尖細(xì)胞活力及結(jié)構(gòu)Fig.2 Cell changes of alfalfa before and after Al stressⅠ：熒光強(qiáng)度，標(biāo)尺0.2 mm Fluorescence intensity，ruler 0.2 mm；Ⅱ：根尖橫截面結(jié)構(gòu)，標(biāo)尺50 μm Root cross-sectional structure，ruler 50 μm.

2.5 根系鋁含量

在對照組中阿爾岡金和UC-1465 的Al 含量分別為36.37 和50.01 μg·g-1；經(jīng)過50 μmol·L-1AlCl3處理后的阿爾岡金和UC-1465 的鋁含量分別為72.71 和112.70 μg·g-1，處理組中UC-1465 和阿爾岡金根系的Al 含量均顯著（P＜0.05）增加，且UC-1465 的根系A(chǔ)l 含量顯著（P＜0.05）高于阿爾岡金（圖3）。

圖3 鋁脅迫對UC-1465 和阿爾岡金根系A(chǔ)l 濃度的影響Fig. 3 Effect of Al stress on Al concentration in roots of UC-1465 and Algonquin

2.6 根系有機(jī)酸含量測定

與對照相比脅迫后兩個品種的有機(jī)酸含量均有增加，如圖4 所示：脅迫前阿爾岡金和UC-1465 的草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、反丁烯 二 酸 含 量 分 別 為248117.16 μg·mL-1、705.03 μg·mL-1、70.84 μg·mL-1、441.87 μg·mL-1、162.44 μg·mL-1、99.58 μg·mL-1、3111.92 μg·mL-1、984.60 μg·mL-1和114474.70 μg·mL-1、176.66 μg·mL-1、33.36 μg·mL-1、408.16 μg·mL-1、65.32 μg·mL-1、58.27 μg·mL-1、2309.79 μg·mL-1、818.70 μg·mL-1，脅迫后草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、反丁 烯 二 酸 含 量 分 別 為308731.41 μg·mL-1、5475.61 μg·mL-1、290.29 μg·mL-1、702.96 μg·mL-1、249.93 μg·mL-1、3122.88 μg·mL-1、3119.34 μg·mL-1、1346.66 μg·mL-1和303701.88 μg·mL-1、5047.51 μg·mL-1、143.81 μg·mL-1、572.42 μg·mL-1、206.91 μg·mL-1、2371.91 μg·mL-1、2366.58 μg·mL-1、1178.73 μg·mL-1，相比于酸鋁處理前兩個品種的草酸、酒石酸、蘋果酸、乙酸、檸檬酸、反丁烯二酸含量均顯著增高（P＜0.05），乳酸含量雖有增加，但不顯著；在酸鋁脅迫24 h 后，阿爾岡金的蘋果酸含量顯著（P＜0.05）高于UC-1465。

圖4 紫花苜蓿根系鋁處理0、24 h 的有機(jī)酸含量Fig.4 The content of organic acids in alfalfa roots treated with aluminum at 0 and 24 h

3 討論

3.1 紫花苜蓿適應(yīng)性評價

李文英等［17］研究表明不同經(jīng)緯度種植的蒙古櫟（Quercus mongolica）其表型性狀與地理氣候因子存在顯著或極顯著的相關(guān)關(guān)系，說明植物的生長主要受到基因及環(huán)境的綜合作用。關(guān)于基因與環(huán)境的互作，不同作物品種都有其最適宜的種植和推廣區(qū)域，本研究對紫花苜蓿兩地一年多品種產(chǎn)量進(jìn)行綜合評價，能真正反映不同品種的適應(yīng)性，從而獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。本研究對貴陽和石阡44 份紫花苜蓿品種測量的總干重綜合評價，得到5 個產(chǎn)量高且適應(yīng)性強(qiáng)的紫花苜蓿品種，分別為阿爾岡金、新疆大葉苜蓿、Trifecta、Vernal 和中牧1 號苜蓿；這與劉明秀［18］、莫本田等［19］、柳海鷹［20］的研究結(jié)果有差異，這可能與品種特性、生境條件、種植密度、栽培方式和刈割次數(shù)的不同有關(guān)。

3.2 兩個品種的抗鋁性評價

王運(yùn)琦等［21］研究發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿的存活率會隨著脅迫濃度的增大而變小；Tamás 等［22］觀察到Al 處理24 h 后大麥（Hordeum vulgare）根尖相對鋁含量呈上升趨勢；Silva 等［23］觀察到小麥根尖Al 處理24、72 h 后耐鋁品種和敏感品種根尖鋁含量均上升，且敏感型大于耐受型。本研究發(fā)現(xiàn)，鋁脅迫前后兩個品種根尖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，敏感型細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致其根系喪失對重金屬離子的防御功能，電導(dǎo)率顯著增大，這與前人研究結(jié)果一致［14，24-25］。

3.3 有機(jī)酸在鋁抗性中的作用

大量研究表明，鋁脅迫下根系分泌有機(jī)酸是植物耐受鋁的主要機(jī)制之一。Liao 等［26］的研究得出檸檬酸、蘋果酸、草酸是植物抵御鋁脅迫的重要機(jī)制。根系分泌的有機(jī)酸可絡(luò)合鋁離子，有機(jī)酸是關(guān)鍵的鋁解毒劑［27］。檸檬酸和蘋果酸是大多數(shù)植物根尖適應(yīng)鋁毒性所分泌的主要有機(jī)酸［28-30］。Silva 等［23］對不同基因型大豆（Glycine max）進(jìn)行Al 處理，前6 h 所有基因型的檸檬酸和蘋果酸外排均增加，但只有耐鋁基因型的檸檬酸和蘋果酸外排持續(xù)時間較長。Ling 等［31］研究發(fā)現(xiàn)鋁脅迫會促進(jìn)黑麥（Secale cereale）分泌檸檬酸，鋁脅迫濃度越高，時間越長，檸檬酸分泌量越大。Miyasaka 等［30］研究表明，鋁脅迫下耐受型菜豆（Phaseolus vulgaris）品種分泌的檸檬酸是對照組的70 倍，且耐受品種分泌的檸檬酸含量較敏感品種高10 倍。Yang 等［32］研究也發(fā)現(xiàn)，鋁脅迫下，耐受型品種分泌的檸檬酸比敏感品種高。本研究中，Al 處理下阿爾岡金與UC-1465 的根系檸檬酸、蘋果酸、乙酸、酒石酸、反丁烯二酸、草酸和琥珀酸分泌均顯著（P＜0.05）增加，表明紫花苜蓿可通過分泌有機(jī)酸來緩解鋁毒。同時，阿爾岡金與UC-1465 根系檸檬酸分泌量增加最為明顯，說明檸檬酸可能是紫花苜蓿緩解鋁毒的主要解毒劑，這與Takashi等［33］、Wu 等［34］、Dai 等［35］、Liu 等［36］、Yang 等［37］的研究結(jié)果一致。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)脅迫前后兩個品種間僅蘋果酸差異達(dá)到顯著水平。而Sun 等［14］對不同耐鋁性紫花苜蓿品種進(jìn)行鋁脅迫研究，結(jié)果表明耐受型品種檸檬酸含量顯著高于敏感型品種，而蘋果酸無顯著（P＞0.05）差異，本研究結(jié)果與其不一致。結(jié)果表明，不同紫花苜蓿品種有機(jī)酸合成與分泌存在差異，且耐受型紫花苜蓿防御酸鋁脅迫策略不同為后續(xù)研究提供了新的思路。

4 結(jié)論

通過兩個試驗點的產(chǎn)量分析，從44 份紫花苜蓿品種中篩選出阿爾岡金、新疆大葉苜蓿、Trifecta、Vernal 和中牧1 號苜蓿5 個強(qiáng)適應(yīng)品種。紫花苜蓿對酸鋁脅迫的響應(yīng)主要通過檸檬酸、蘋果酸、乙酸、酒石酸、反丁烯二酸和草酸的顯著（P＜0.05）增加來體現(xiàn)，所以有機(jī)酸（尤其是蘋果酸）的合成和分泌增多可能是其耐酸鋁脅迫的重要原因。