壯族家系顯性視網膜色素變性RHO基因的突變篩查

覃莉等、

【摘要】目的探討一壯族常染色體顯性遺傳（ADRP）視網膜色素變性（RP）家系視紫紅質（RHO）基因第58、347密碼子是否存在突變。 方法采集一連續4代發病的壯族ADRP家系29名成員外周血DNA，應用聚合酶鏈式反應限制性片段長度多態性法對RHO基因的上述密碼子進行檢測。結果RHO基因第58、347密碼子在該壯族家系中未發現突變。結論該壯族家系ADRP發病與RHO基因第58、347密碼子不相關，其發病的分子遺傳學機制有待進一步研究。

【關鍵詞】視網膜色素變性；常染色體顯性遺傳；RHO基因；限制性片段長度多態性

中圖分類號：R774.1 文獻標識碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.04.003

【Abstract】ObjectiveTo investigate whether mutation existed in codon 58 and codon 347 of rhodopsin （RHO） gene of retinitis pigmentosa （RP）in a Zhuang family with autosomal dominant retinitis pigmentosa （ADRP）.MethodsPeripheral blood DNA of 29 members was collected from a Zhuang family whose four generations had suffered from ADRP.Polymerase chain reaction （PCR）―Restriction fragment length polymorphism （RFLP） was applied to detect the codon 58 and codon 347 of RHO gene.Results No mutations were found in the codon 58 and codon 347 of RHO gene in this family.ConclusionThere is no relation between the morbidity of ADRP and the codon 58 and codon 347 of RHO gene in the Zhuang family.And further research is needed to be carried out on the molecular genetic mechanism of its onset.

【Key words】RP；ADRP；RHO gene；RFLP

視網膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP）是一組以視網膜感光細胞和色素上皮進行性受損為主要特征的遺傳性眼病。我國的平均患病率約為 1/3784[1]，其遺傳方式主要為常染色體顯性遺傳（autosomal dominant RP，ADRP）、常染色體隱性遺傳（autosomal recessive RP，ARRP）、X染色體連鎖遺傳（Xlinked RP，XLRP）和雙基因遺傳。迄今為止，視紫紅質（rhodopsin，RHO）基因突變引起的ADRP為265%，我國 ADRP 患者約有 7%由此基因引起[2]，是ADRP基因中突變率最高的，故RHO成為ADRP分子缺陷研究的第一候選基因。本研究對廣西一ADRP壯族家系RHO基因Exon 1、5外顯子的第58、347密碼子是否存在與發病關聯的突變進行初步篩查。

1對象與方法1.1對象 研究家系來自廣西壯族自治區貴港市。詢問家系成員病史并繪制家系圖譜（見圖1）。采集10例患者（男6例、女4例）和19例正常成員的外周血。所有研究對象均進行常規體檢及眼部檢查（包括視力、眼底、眼壓等）。 圖1 壯族ADRP家系系譜圖。

1.2方法

1.2.1外周血DNA制備采集該家系中10例患者、19名正常成員靜脈血2 ml， 加ACD抗凝，用經典的苯酚/氯仿法提取白細胞DNA，TE緩沖液溶解，置4℃備用。

1.2.2引物設計及PCR擴增 參照文獻[3]設計引物，擴增RHO基因Exon 1、5的部分片段，由上海生物工程公司合成2對引物（見表1）。PCR擴增反應體系（30 μl）：模板DNA 1 μl，正反向引物各1 μl，Taq酶0.1 μl（5 U/μl），dNTP 3 μl（2.5 mmol/L），10×buffer（Mg2+）4 μl，無菌注射用水19.9 μl。反應過程分3個階段：第1階段，95℃預變性 5 min；第2階段，以 93℃變性1 min，54.5℃退火 1 min，71℃延伸 100 s，為 1個循環，共30個循環；第3階段，71℃再延伸 5 min，8℃保存備用。取5 μl PCR擴增產物，在1.5%瓊脂糖凝膠，用電壓100 V，電流150 mA電泳40～50 min，紫外光透射儀上觀察并拍攝DNA帶紋，證實PCR擴增片段存在。

1.2.3限制性片段長度多態性（RELP）PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳確認后，各取10 μl分別加0.5（10 U/μl）DdeI， 1 μl（10 U/μl）MspI，37℃恒溫水浴中消化過夜，消化產物于12%聚丙酰胺凝膠90 V恒電壓下電泳1.5小時，EB染色20分鐘，紫外光透射儀上觀察并拍攝DNA帶紋。

2結果2.1瓊脂糖凝膠電泳分析結果家系中患者和正常成員的RHO基因PCR擴增產物為Exon 1基因片段360 bp；、Exon 5基因片段277 bp（見圖2、圖3）。

2.2限制性內切酶酶切電泳分析結果DdeI酶切Exon 1片段的消化產物電泳后呈現310 bp和50 bp DNA條帶兩個（見圖4）。MspI酶消化Exon 5片段后電泳可見56、100、121 bp三個DNA帶型格局（見圖5）。

3討論根據RP診斷標準，該家系4代，每代可見患者，男女發病率之比為8∶5，近似于1∶1，雙親無病的子女不患病，29名成員中10例被確診為ADRP患者。該家系患者中，夜盲為始發癥狀，漸出現視野縮小，視力減退，累及雙眼至最終雙眼的視力無光感，提示癥狀隨著年齡增長而逐漸加重。該家系的臨床表型特點為：發病時間年齡差異大，第Ⅰ～Ⅲ代較晚（30～40歲左右），第Ⅳ代目前只有Ⅳ4（10歲左右）表現出RP的臨床癥狀。家系中Ⅱ11（72歲）、Ⅱ13（76歲）、Ⅲ22（43歲）、Ⅲ31（46歲）雙眼已無光感，前3名患者及先癥者Ⅱ7（75歲）合并青光眼，Ⅲ31合并白內障。家系不同患者間的臨床表現存在差異，顯示表型異質性。

ADRP最常見的致病基因RHO基因迄今已發現100 余種[4]突變與ADRP有關，其中 90%以上的突變表現為無義或錯義突變，少數為微小缺失或插入突變。這些突變中，Pro23His 和 Pro347Leu 在歐美最為常見，我國以 Pro347 Leu 突變[5]為主，亦有第58密碼子突變的發現[6]，Pro 23 His突變尚未發現。因此本研究首先選取RHO基因Exon 1、5外顯子的第58、347密碼子進行突變篩查。

本研究應用聚合酶鏈式反應限制性片段長度多態性法分析RHO基因Exon 1、5外顯子的第58、347密碼子。DdeI酶在Exon 1片段內有一個切點，該片段DdeI消化產物電泳后呈現310 bp和50 bp DNA條帶兩個。若第58密碼子發生C→G的點突變時則出現新的DdeI酶切識別位點，致新的酶切片段產生[3]。本研究所檢測的RP病例均呈現與正常對照相同的帶型格局，提示第58密碼子沒有產生新的DdeI酶切識別位點。Exon 5片段內含有位于第314密碼子和347密碼子處的兩個MspI酶切位點，故MspI消化正常人Exon 5片段后電泳可見3個DNA條帶。若第347密碼子發生點突變將使該處的識別位點喪失[3]。本研究所檢測的RP病例均呈現與正常對照相同的56、100、121 bp三個DNA帶型格局，提示該處保持原有的MspI酶切位點。綜上所述患者與家系中的正常對照的擴增序列完全一致，排除在Exon 1、5外顯子擴增區域內存在丟失縮短或插入延長及堿基突變的可能，表明RHO基因第58、347密碼子不存在與該ADRP家系的相關突變。

壯族人群在遺傳背景上表現為與漢族及周圍群體有所不同的獨特性[7～8]，不同地區、不同人群RHO基因突變存在差異性，且RP具有高度遺傳異質性[9]，因此該壯族ADRP家系患者亦可能存在異于其他族群的RHO基因突變格局。我們下一步將應用HTCSGE技術和DNA直接測序方法對RHO基因5個外顯子及其附近拼接序列進行突變篩查，探討RHO基因與該壯族ADRP家系的關聯性。參考文獻[1] 覃泳杰，郭海科.常染色體遺傳型視網膜色素變性相關基因的研究進展[J].眼科研究，2009，27（12）：11591163.

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（收稿日期：2015-05-31修回日期：2015-08-08）

（編輯：梁明佩）

編者·讀者·作者

醫學論著“材料與方法”的撰寫要求

材料是表現研究主題的實物依據，方法是指完成研究主題的手段。材料與方法是科技論文的基礎，是判斷論文科學性、先進性的主要依據。對材料和方法的唯一要求就是使讀者看懂，能夠據此進行重復實驗。如果所采用的方法，是自己獨創的應詳細交代，對在別人方法基礎上有所改進或改良的方法，只需把改進部分的細節作必要的介紹即可。對完全采用別人建立的方法，特別是經典的方法可一筆帶過，注明出處。研究對象如為動物：注明名稱、品種、數量、來源、年齡、性別、分組標準與方法；對象為生物或細胞：注明種、型、株、系、培養條件和實驗室條件；對象為臨床病例：注明來源、數量、性別、年齡、病因、病程、病理診斷、分型標準、選擇標準。

·本刊編輯部·

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