iNOS及VEGF在兔角膜堿燒傷后角膜新生血管生成中的作用研究

徐洋濤等

【摘要】目的研究誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）和血管內皮生長因子（VEGF） 在堿燒傷后兔角膜新生血管（CNV）形成中的作用及其機制。方法用氫氧化鈉濾紙片燒傷兔角膜建立新生血管動物模型，根據不同處理因素將實驗兔分為三個實驗組和一個對照組，每組12只。三個實驗組結膜下注射不同劑量的三氧化二砷；對照組結膜下注射0.9%氯化鈉。在裂隙燈下查看堿燒傷后角膜大體情況，計算角膜新生血管的面積。分別在兔角膜堿燒傷后7天、14天、28天，行兔角膜組織HE染色及免疫組化法檢測iNOS和VEGF。 結果各實驗組角膜新生血管面積均小于對照組 （P<0.05或0.01）；實驗組角膜比對照組更光滑透明；角膜iNOS和VEGF表達情況：各組堿燒傷后第7天開始增高，14天時達到峰值，隨后逐漸降低，并且對照組的表達明顯高于實驗組。結論兔角膜堿燒傷后CNV形成與iNOS和VEGF密切相關；三氧化二砷對CNV形成具有一定抑制作用。

【關鍵詞】一氧化氮合成酶；血管內皮生長因子；三氧化二砷；角膜新生血管

中圖分類號：R774.1 文獻標識碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.04.011

【Abstract】ObjectiveTo study effect and mechanism of inducible nitric oxide synthase （iNOS） and vascular endothelial growth factor（VEGF） in corneal neovascularization （CNV） after corneal alkali burn.MethodsAnimal models of neovascularization were established by burning rabbits corneas with sodium hydroxide filter papers.According to different kinds of treatments，experiment rabbits were divided into three experimental groups and one control group，with 12 rabbits in each group.The three experimental groups were given different doses of As2O3 by subconjunctival injection，while the control group were treated with 0.9% sodium chloride by subconjunctival injection.Corneas after alkali burn were observed under slit lamp，and areas of CNV were calculated.Rabbit corneal tissue HE staining and immunohistochemistry method were used to measure iNOS and VEGF 7，14 and 18 days after corneal alkali burn，respectively.Results Areas of CNV of all experimental groups were smaller than that of the control group（P<0.05 or 0.01），and the corneas of the experimental groups were more smooth and transparent than that of the control group.Expressions of iNOS and VEGF in corneas of all groups began to increase on the 7th day and reached the peak on the 14th day after alkali burn，then decreased gradually.And the expressions of the control group were significantly higher than those of the experimental groups.ConclusionCNV formation after corneal alkali burn is closely related with iNOS and VEGF.Besides，As2O3 has some inhibitory effect on CNV formation.

【Key words】iNOS；VEGF；As2O3；CNV

生理狀態下角膜透明無血管，處于免疫赦免區之中，這是保持角膜正常生理功能的先決條件。在某些病理狀態如炎癥、堿燒傷、移植等時，會出現角膜新生血管。有研究表明，誘導型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）在眼內含量豐富，角膜上皮和內皮均含有iNOS，其促進生成一氧化氮（NO），NO則能促進新生血管的形成[1]，此外iNOS對血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）具有一定調控作用[2～3]，VEGF是新生血管發生發展過程中重要的影響因子，因此在角膜新生血管形成機制的研究中該因子成為研究熱點。目前，對于角膜新生血管的治療非常棘手，至今還沒有特效藥物以及特效的治療方法。近年來研究發現，作為抗腫瘤藥物的三氧化二砷具有抑制新生血管的作用[4]。本研究應用氫氧化鈉濾紙片燒傷兔角膜建立新生血管動物模型，結膜下注射三氧化二砷溶液，觀察兔角膜堿燒傷后角膜新生血管生成的情況，免疫組化染色檢測iNOS、VEGF在角膜新生血管形成過程中的表達，探討角膜新生血管的發生機制。

1材料與方法1.1材料實驗應用試劑：兔抗iNOS單克隆抗體，兔抗VEGF單克隆抗體，DAB顯色試劑盒（購于武漢博士德生物公司）；二步法免疫組化試劑盒（購于北京中山生物技術有限公司）；As2O3（哈爾濱醫科大學第一臨床醫學院醫院提供）。實驗動物：大白兔（哈爾濱醫科大學第一臨床醫學院提供）。48只實驗兔隨機分為0.1 ml組、0.3 ml組和0.5 ml組三個實驗組和一個對照組，每組12只，實驗組結膜下分別注射1 g/L的三氧化二砷0.1 ml，0.3 ml，0.5 ml，對照組0.3 ml生理鹽水結膜下注射；每周兩次。

1.2動物模型制備結膜囊滴倍諾喜表面麻醉，氯胺酮（25 mg每千克體重）肌肉注射麻醉；7 mm直徑濾紙片浸入1 mol/L的氫氧化鈉溶液中30秒，取出置于兔角膜中央2分鐘后拿開濾紙，用生理鹽水沖洗；適量紅霉素眼膏及阿托品眼膏涂于結膜囊內。堿燒傷后每日在裂隙燈下觀察兔角膜，每次測量角膜新生血管的長度和數量，并記錄。應用Robert電腦數學模型公式：A=C/12×3.1416[r2（rL）2]（A代表新生血管面積，C為CNV累及角膜的圓周鐘點數，L為CNV長入角膜的長度，r代表角膜半徑）計算角膜堿燒傷后6天、12天、15天、21天及28天CNV面積，并分別于堿燒傷后7天、14天、28天拍攝兔角膜外觀圖像（見圖1）。

1.3HE染色及免疫組化染色燒傷后第7天、14天、28天各組隨機空氣栓塞處死4只兔，取角膜組織，4%多聚甲醛固定液中固定、石蠟包埋切片，行HE染色（見圖2）。免疫組化染色應用PowerVisionTM二步法，一抗為兔抗iNOS、兔抗VEGF，二抗為羊抗兔抗體。

2.2免疫組化檢測iNOS及VEGF表達情況在堿燒傷后第7天，角鞏膜緣前部基質新生血管管壁內皮細胞及炎性細胞胞漿可見iNOS和VEGF表達；對照組較實驗組表達多（見圖3、 圖4）。堿燒傷后第14天，對照組表達iNOS及VEGF的炎性細胞及新生血管內皮細胞異常增多，三個實驗組iNOS及VEGF表達與三氧化二砷用量成反比。堿燒傷后第28天，各組iNOS及VEGF表達均減少，且iNOS及VEGF表達情況基本一致。整體來看，在角膜堿燒傷后第7天時iNOS及VEGF表達較為顯著，14天時表達達到一個明顯高峰，之后表達開始降低。三個實驗組的表達均低于對照組，結膜下應用三氧化二砷劑量與新生血管面積成反比。

3討論角膜堿燒傷修復過程中，在炎癥及缺氧狀態下，新生血管自角膜緣向角膜中央生長。在此過程中多種細胞因子參與新生血管的生長調控。目前，研究發現VEGF是最強的促血管生成因子，它作用于血管內皮細胞，促進其分裂、增生、遷移并增強血管通透性[5]。一氧化氮（NO）是血管新生細胞內信號傳遞系統中重要的調節因子，短期暴露于VEGF下所產生的NO是激活酪氨酸激酶及三磷酸肌醇激酶后介導產生的，長期暴露于VEGF下所產生的NO是通過增加一氧化氮合成酶的表達實現的。一氧化氮合成酶是合成一氧化氮的限速酶，催化L精氨酸生成NO。研究發現NO能夠誘導VEGF的表達并且調節VEGF的促新生血管的功能[6]。NOS主要分布在血管平滑肌細胞、血管內皮細胞以及各種炎癥細胞的胞質內[7]。目前已確定三種不同類型的NOS，即誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）、神經核結構型一氧化氮合成酶（nNOS）及內皮結構型一氧化氮合成酶（eNOS）。eNOS僅能產生少量的NO，在完成神經系統的生理功能起著一定作用，例如它能調節平滑肌細胞的增生[8]。而iNOS是NO合成的關鍵酶，在炎癥、外傷等刺激下，iNOS mRNA翻譯產生促進CNV生成的NO[9]。而NO則是血管生成過程中重要的參與因素[10]。因此，在炎癥、缺氧等因素下iNOS促進NO的生成，進而NO加強VEGF的促新生血管的作用。此外，有研究發現iNOS及VEGF是腫瘤生長過程中重要的參與因子，iNOS存在水平與VEGF相平行，促進NO合成以及調節VEGF水平是iNOS促新生血管形成的主要途徑[11～13]。

本實驗通過建立兔角膜堿燒傷模型，觀察三氧化二砷對角膜新生血管形成過程的影響及探討角膜新生血管形成機制。此次研究觀察到角膜堿燒傷后免疫組化iNOS和VEGF表達明顯增強，并具有一致的變化趨勢，其主要分布在角膜前基質內炎性細胞以及新生血管內皮細胞；結膜下應用三氧化二砷后角膜新生血管面積明顯少于對照組。因此我們認為，角膜新生血管的形成過程中，iNOS和VEGF是參與其中的重要細胞因子，并且三氧化二砷具有抑制角膜新生血管的作用。參考文獻[1] Kon K，Fujii S，Kosaka H，et al. T.Nitric oxide synthase inhibition by N（G）nitroLarginine methyl ester retards vascular sprouting in angiogenesis[J].Microvasc Res，2003，65（1）：28.

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