eNOS對糖尿病視網膜病變的研究進展

汪權志+夏媛玲

摘要：糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy ，DR）是糖尿病在眼部常見并發癥，微血管的病變導致相關并發癥嚴重影響患者視覺和生活質量。而內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）作為血管內皮細胞代謝中的限速酶，在糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy ，DR）疾病進展中可能有一定的作用。本文對內皮型一氧化氮合酶在糖尿病視網膜病變研究進展進行綜述。

關鍵詞：糖尿病視網膜病變； 內皮型一氧化氮合酶 ；血管內皮生長因子

Research Progress of Endothelial Nitric Oxide Synthase on Diabetic Retinopathy

WANG Quan-zhi1，XIA Yuan-ling2

（1.Guizhou Medical University，Guiyang 550025，Guizhou，China；2.Ophthalmology Department，The Affiliated Hospital of Guizhou Medical University，Guiyang 550000，Guizhou，China）

Abstract：Diabetic retinopathy is a common complication of diabetes in the eye， microvascular disease-related complications seriously affect the patient's visual and quality of life. Endothelial nitric oxide synthase， a rate-limiting enzyme in the metabolism of vascular endothelial cells， may play a role in the progression of diabetic retinopathy. This review summarizes the progress of endothelial nitric oxide synthase in diabetic retinopathy.

Key words：Diabetic retinopathy；Endothelial nitric oxide synthase （eNOS）；Vascular endothelial growth factor

糖尿病視網膜病變（DR）在人群中發病率逐年增高，據一項對751個數據的研究分析，到2014年全球糖尿病患病率達到4.22億[1]。目前認為DR發病的危險因素主要包括年齡、血糖水平、血壓水平、胰島素使用及遺傳等因素。DR在眼部常見于視網膜血管改變，繼而導致一系列眼部并發癥，如視網膜新生血管、視網膜黃斑水腫、眼底出血、視網膜脫離、新生血管性青光眼等嚴重危害患者視力，降低患者生活質量并帶來一定的經濟負擔[2]。內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS） 存在于血管內皮細胞，是產生一氧化氮（nitric oxide，NO）的限速酶，而NO作為重要的血管調控因子，在DR進展中占有一定地位，現就eNOS在DR研究做一綜述。

1 eNOS及NO的作用

正常生理情況下 NOS是一組同工酶，根據其不同的蛋白結構和mRNA 表達的組織特異性分為3種亞型：誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、神經型一氧化氮合酶（nNOS）和內皮型一氧化氮合酶（eNOS）[2]。其中eNOS基因位于7號染色體（7q35 36），含有26個外顯子，長達21kb，編碼的mRNA 包括了4，052個核苷酸[3]。經典理論認為，eNOS需要與鈣調蛋白結合變構之后才能活化，而后者需要在Ca2+濃度升高的條件下才能發生變構與eNOS結合。eNOS以左旋精氨酸（L-Arg）為底物，在NOS催化下生成NO參與維持循環系統的穩態平衡。NO在體內能夠維持血管的張力、微血管的完整性及通透性，且具有很強的抗血小板聚集和預防血栓形成的作用。許多心血管系統疾病，如高血壓、動脈粥樣硬化等都與內皮功能紊亂致NO的合成障礙密切相關。

2 eNOS基因在DR中的表現

糖尿病長期高血糖對視網膜微血管的刺激是DR主要原因，但臨床也有發現部分患者血糖控制良好但也會發生DR，而有的患者長期血糖控制不佳卻沒有發生DR，可能遺傳因素在DR發展過程起一定作用。eNOS基因可能在體內支配DR血管功能調控起重要作用。AlI MoMenI 等[4]在一項橫斷面調查研究中，對94例2型糖尿病視網膜病變患者與94例正常人血液行eNOS合酶基因型（TT，GT or GG）多樣性分析，發現糖尿病視網膜病變患者血液中eNOS合酶基因型多樣性較正常人常見。Cilen？觢ek I等[5]在一項實驗組為172例增殖期糖尿病視網膜病變（proliferative diabetic retinopathy，PDR）患者，對照組為405例糖尿病但沒有視網膜病變進行eNOS基因的VNTR a/b 多態性進行分析，發現攜帶基因型 為4a/4a的個體比基因型 4b/4a和4b/4b 的個體患PDR的風險高2.9倍。但佘重陽等[6]在eNOS基因內含子的數目可變串連重復多態性一項研究發現，eNOS基因VNTR 4a/b多態性4a/b基因型分布DR組（bb 78.5%，ab 21.5%，aa0.0%）與DWR組（bb 77.7%，ab 21.6%，aa0.7%）相比差異沒有統計學意義（χ2=0.88，P=0.643）。在一項eNOS基因 a/b 多態性與DR關系多數據的Meta分析中，DR發病總體易感性與eNOS 基因 a/b 多態性無相關性，但在種族上分析中發現，eNOS 基因 a/b 多態性可能在非洲人群DR起重要作用[7]。

有研究顯示糖尿病合并視網膜病變和糖尿病無病變患者中發現eNOS的基因多態性在第4內含子中無顯著差異性[8]。Li Q等[9]在一項以小鼠被敲掉eNOS基因并被鏈脲霉素（streptozotocin STZ）誘導成糖尿病的試驗研究中，發現eNOS介導內皮衍生的NO的缺乏，伴隨iNOS的活化，可以產生更多NO，當遇到活性氧時，可以產生高度活性的氮物質，導致氧化應激，和加速的視網膜病變。

3 eNOS在DR眼部表現

糖尿病是一種以慢性高血糖為特征性表現的代謝性疾病，由于糖代謝紊亂可引起多系統、器官的損害。長期的高血糖刺激可引起眼睛多種組織的解剖功能及結構障礙。eNOS在眼球各層組織結構，如視網膜神經纖維和血管細胞、色素上皮細胞、虹膜等中均廣泛存在，在其介導的血管舒張功能下降、血管通透性增加、炎癥反應、內皮細胞脫落等病理損傷中起著重要作用。

3.1 eNOS在DR房水中特點 Sevsen Kulaks等[10]在一 項前瞻性的研究中，對患有白內障的35例增殖期2型糖尿病視網膜病變實驗組與35例年齡和性別匹配對照組研究中，發現增殖期糖尿病視網膜患者房水中NO濃度與對照組有顯著差異，然而增殖期糖尿病視網膜患者血清中NO濃度與對照組無明顯差異。已有研究表明羥基-L-精氨酸（HOArg）是生成 NO底物。Hattenbach，L-0等[11]在一項研究中發現，房水中HOArg水平在非糖尿病和糖尿病受試者中比較，HOArg在糖尿病患者中顯示出顯著更高的水平，眼內NO產生的控制可能構成糖尿病性視網膜病變中的潛在治療方法。

3.2 eNOS在DR白內障中的表現 研究發現多元醇代謝路徑是糖尿病中并發白內障重要機制，糖尿病引起晶狀體的高糖環境導致多元醇在晶狀體內蓄積引起糖性白內障。蘇文成等[12]在研究糖尿病對白內障作用機制中，發現糖尿病合并年齡相關性白內障組房水中NO含量較單純年齡相關性白內障組高，有顯著的統計學差異。

張筠等[13]在研究NOS抑制劑（硝基左旋精氨酸甲酯L-NAME）對半乳糖白內障小鼠防治作用中，隨機分為對照組、模型組、L-NAME組3個組，每組各20只，模型組、L-NAME組給予50%D一半乳糖溶液，L-NAME組同時用L-NAME滴眼液點眼。30 d后摘除晶狀體并行實驗分析。與對照組比較，后兩組NO含量明顯升高，模型組晶狀體NO含量較L-NAME組高，具有統計學意義。在NOS分析中模型組含量明顯高于對照組，L-NAME組大鼠亦高于對照組，差異均有統計學意義。可能eNOS通過房水在糖尿病患者中介導白內障的進展中有一定作用。

3.2 eNOS在DR玻璃體中表現 PDR由于局部缺血缺氧致病理性血管在視網膜中生成，新生的血管脆性和穩定性都較生理性血管差，易導致視網膜病理性出血聚集玻璃體中，玻璃體血液機化，容易牽拉致視網膜脫離。以18例PDR患者并發視網膜脫離行玻璃體切除術作為實驗組，15例尸體和3例黃斑裂孔眼行玻璃體切除術為對照組，發現實驗組玻璃體中NO含量較對照組高[14]。Diederen RM等[15]通過NO代謝途徑中的底物來研究NO在PDR患者中作用，通過手術過程取患者玻璃體來分析，發現NO合成途徑的底物精氨酸在PDR組較對照組升高，有統計學差異。Gao L等[16]在研究NO含量在PDR患者玻璃體中病理改變，考慮到NO生物活性半衰期較短，用硝酸鹽間接來測量其含量。取27例PDR需行玻璃體切除術和35例沒有糖尿病但須玻璃體切除術玻璃體液分析，結果硝酸鹽在PDR組較對照組玻璃體含量高（41.17±4.09μM vs. 15.22±0.86μM，P=0.000001），有顯著統計學意義，間接說明NO在DR中玻璃體病變有著密切關聯。而病理性新生血管在DR中常見，eNOS可能在PDR通過NO的介導在玻璃體中高表達。

3.3 eNOS與VEGF在DR中關系

3.3.1 VEGF在DR中作用 DR由于持續高血糖及其他相關因素的刺激，導致視網膜微血管發生一系列改變，以視網膜毛細血管網內皮細胞損害為主要病理改變。如視網膜微動脈瘤 、滲出、棉絨斑等，由于局部血管組織結構遭到破壞，導致視網膜缺血缺氧，進而促進新生血管的生成，而VEGF作為促血管生成因子，在DR演變中有重要作用。

Wakabayashi Y等[17]在一項檢測52例PDR行玻璃體切除術后VEGF水平中，發現術后玻璃體和房水中VEGF濃度升高與并發玻璃體出血和新生血管性青光眼有關。武淑玲等[18]在一項臨床試驗研究中，試驗組為40例PDR，對照組為40例年齡相關性白內障外無全身其他疾病患者，分別檢測玻璃體、房水、血漿中 VEGF、t-PA、PAI濃度，發現PDR組玻璃體、房水中VEGF濃度較對照組升高，有顯著差異。在一項印度人群中的研究中，探索VEGF 與 eNOS在DR和糖尿病不合并病視網膜病變作用，發現VEGF的5'UTR和啟動子區的多態性在DR遺傳中有一定作用[8]。

Abu El-Asrar AM[19]等在研究增殖期DR患者玻璃體血管生成觸發因素中，實驗組為34例PDR患者，其中23例患者并發視網膜脫離，13例患者合并玻璃體出血，對照組為15例孔源性視網膜脫離但沒有合并增值性玻璃體視網膜病變，在行玻璃體手術過程中取2組玻璃體進行分析，sVEGFR-2在實驗組較對照組有明顯升高。Maugeri G等[20]在用人的REP細胞在高糖的微環境中模擬糖尿病黃斑水腫細胞，發現Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide（PACAP）and vasoactive intestinal peptide（VIP）能通過升高HIF-3α來降低HIF-1α從而來降低VEGF，從而保護黃斑水腫。DME和PDR作為DR常見并發癥，在人群的研究表明，約1/3的糖尿患者群具有DR的跡象，并且約1/10有DME或PDR等并發癥而威脅到視覺[21]。可見VEGF在介導以上兩種并發癥中扮演著重要作用。

3.3.2 eNOS與VEGF Youde Jiang等[22]在關于Compound49b（一種β-腎上腺素能受體激動劑）在減少1型糖尿病視網膜病變模型的小鼠VEGF水平研究中，通過誘導小鼠為糖尿病鼠，取小鼠視網膜內皮細胞進行不同物質對比分析，得出Compound 49b是通過增加IGFBP-3來減少VEGF的水平，而IGFBP-3主要通過在調控eNOS，PKCζ和PKCδ途徑來實現。Koai E等[23]在 血管內皮生長因子是否改變內皮一氧化氮合酶轉錄研究中結果表明：VEGF在eNOS-mRNA上升之前快速激活eNOS轉錄。Qiuhua Zhang等[24]探索insulin-like growth factor binding protein-3（IGFBP-3）如何在糖尿病中降低 VEGF過程中，用人的視網膜內皮細胞分別在正常葡萄糖和高濃度葡萄糖下培養，然后轉染IGFBP-3 NB 質粒，分析PKCzeta、eNOS和VEGF之間關系，發現eNOS被抑制在這個過程中起著重要作用。

García C等[25]在一項研究發現Vasoinhibins在阻止DR的過程是通過抑制eNOS磷酸化，來降低VEGF的水平。梅開等[26]也在eNOS在影響腫瘤血管生成的研究中，也發現eNOS在抑制VEGF進而影響腫瘤血管的生成。可見eNOS與VEGF相互作用，共同調控機體血管的生成。在PDR期視網膜血管供氧障礙導致新生異常血管引起眼內一系列并發癥，如眼底出血、視網膜脫離、新生血管性青光眼等影響患者視力，如果在進行eNOS的靶向治療可能會抑制DR的進展。

4 總結與展望

隨著人們生活水平的提高，DR發病率越來越高，對人們視覺質量有重要的相關性。現階段對DR的研究，特別是分子水平的研究越來越深入，關于其病理機制及各種促進因素將逐步被揭曉。eNOS在DR進展中具有重要作用，eNOS在DR的中作用機制復雜，可能與VEGF共同作用促進新生血管增生及視網膜黃斑水腫等相關并發癥發生。在并發玻璃體病變中NO可能與eNOS存在某種聯系，有待研究進一步的深入。糖尿病并發白內障發病率明顯較普通白內障發病率高，eNOS也可能在其中發揮重要作用。關于eNOS基因研究，世界不同地區、種族有所差異，相信隨著研究樣本數量的增加，人們對eNOS基因在DR中作用會更加明朗。對DR的研究還任重道遠，eNOS與糖尿病的眼部并發癥均有明顯聯系，可能不久的將來會成為糖尿病眼部并發癥預防和治療的研究熱點。

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編輯/金昊天