基于PCR－RFLP技術的苯硫脲嘗味的群體遺傳學分析*

王曉博，楊 麗

(內蒙古大學)

0 引言

苯硫脲(phenylthiocarbamide，PTC)是一種白色結晶狀化合物，由于含有N－C=S基團，呈苦澀味［1］.人類對苯硫脲的嘗味能力具有顯著的遺傳學特征［1］，人 PTC苦味的嘗味能力由7號染色體上(7q35－7q36)的一種苦味味覺感受器基因TAS2R38決定，該等位基因符合孟德爾遺傳性狀，屬于常染色體不完全顯性遺傳，可以采用閾值法測定苯硫脲的嘗味敏感性［2－4］.絕大多數嘗味者與味盲者的區別在于三處單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs).味盲者的PTC編碼區有五個限制性內切酶Fnu4H1的識別位點(識別序列5＇－ GC↓NGC–3＇)，如果是嘗味者，則其第785位SNP恰好形成了一個額外的Fnu4H1識別位點(GCTGC).因此可以利用這個SNP造成的限制性位點多態性，設計引物，克隆該基因，酶切電泳確定并驗證基因型［5］.

1 調查對象與實驗材料

1.1 調查對象

受試者為在校大學生，年齡為20～23歲，共120人，其中男生40人，女生80人.

1.2 實驗材料

1.2.1 基因型檢測材料

受試者用滅菌牙簽刮取口腔上皮細胞，用于提取目的基因;PCR引物委托上海生工生物技術有限公司合成，預期擴增產物303bp;

上游引物:hPTC Forward5’－aactggcagaataaagatctcaatttat－3’

下游引物:hPTC Reverse5’－aacacaaaccatcacccctatttt－3’

1.2.2 試劑和工具酶

苯硫脲 (PTC)結晶，dNTPs，Tris堿，Na2EDTA·2H2O，蛋白酶K，溴化乙錠，瓊脂糖，100 bp DNA ladder Marker，滅菌超純水等，Taq DNA聚合酶，限制性內切酶Fnu4H1等.

1.3 方法

1.3.1 試劑的配制

稱取苯硫脲結晶與超純水制成濃度梯度依次為 1/1500、1/3000、1/6000、1/12000、1/24000、1/48000、 1/96000、 1/192000、 1/384000、1/768000、1/1536000、1/3072000、1/6144000 的14種PTC溶液，標號1～14，過濾滅菌;另取蒸餾水作為第15號液.

1.3.2 PTC 嘗味能力的測定

用滴管滴3～4滴14號液于受試者舌根部，讓其嘗味，之后用蒸餾水做同樣試驗;受試者若不能準確鑒別兩種溶液的味道，則用13號溶液重復試驗，(按濃度遞增以此類推)直至能明確鑒別出PTC的苦味為止;當受試者鑒別出某一號溶液時，用此號溶液重復嘗味3次，若結果相同時，則記錄此時的濃度等級號，若受試者直到1號液仍嘗不出苦味，則其嘗味濃度等級定為＜1號.

1.3.3 人口腔上皮細胞總DNA的提取

在1.5 mL滅菌離心管中加入200 μL緩沖液Chelex;受試者用無菌牙簽輕刮口腔腮內側，刮下來的細胞在緩沖液中漂洗;加2 μL蛋白酶K，蓋蓋顛倒混勻，56℃水浴30 min;冷卻室溫，渦旋振蕩器渦旋振蕩混勻10 s;離心機13200 rmp瞬時離心10 s;沸水浴中煮沸8 min;渦旋振蕩器渦旋振蕩混勻20 s，離心機13200 rpm離心3 min;基因組DNA于4℃保存備用.

1.3.4 PCR擴增PTC基因片段及檢測

PCR產物4℃保存備用.將PTC基因PCR擴增產物電泳檢測，在凝膠成像系統中拍照.1.3.5 PTC基因PCR產物酶切及電泳檢測

將PTC基因PCR產物37℃恒溫Fnu4H1酶切3h或過夜，酶切產物4℃保存備用.分別依次加入 100 bp DNA ladder Marker對照，10 μL PCR產物對照，電泳50 min;凝膠EB染色后，放入凝膠成像系統中拍照.

表1 120名學生PTC嘗味能力測試結果

2 結果與分析

2.1 PTC嘗味能力分布

120名學生PTC嘗味閾值統計結果見表1，圖1、圖2為PTC嘗味能力分布圖.從圖中可以看出，PTC嘗味能力呈雙峰分布，且雙峰性十分明顯，雙峰間的谷底是6號溶液處，故確定第6號液為味盲界限.不能嘗出6號溶液及以上(＜6)者為味盲，共檢出 14人，味盲率為11.67%，其中不能嘗出1號溶液的6人，占全部味盲總數的42.86%，峰值在 ＜1位置;能嘗出6～14號濃度的為嘗味者，共106人，占88.33%，閾值集中在7～9號濃度范圍內，峰值在9號處.嘗味者中以7號至10號為嘗味者雜合體，檢出101人;11～14號為純合體，檢出5人.嘗味者平均嘗味閾值(±SD)為7.900±1.6886.

圖1 PTC嘗味能力測試結果(按性別劃分)

圖2 PTC嘗味能力測試結果(按地域劃分)

2.2 性別與PTC嘗味能力的關系

苯硫脲味盲基因存在于7號常染色體上，因此從理論上講，男、女味盲率應該沒有顯著差異，但文獻報道，女性味盲率高于男性［6－7］.在收集的資料中，從表1可以看出，40名男生中，嘗味者34人，平均閾值為7.5500±1.0720;味盲者6人，占15%;80位女生中，嘗味者72人，平均閾值為8.075±2.2460;味盲者 8 人，占 10%.女生味盲率(10%)較男生味盲率(15%)偏低，此現象的原因可能與男女兩性舌部的解剖學差異相關，平均而言，女性比男性具有更多的蕈狀味蕾、有更多的味孔，所以女性與男性相比對PTC苦味更加敏感［8－9］.此外，男女嘗味者平均閾值的差異，經t檢驗，t=1.28 ＜2.5，無顯著性差異.男女味盲率的差異經χ2檢驗，P＞0.05，也無顯著意義.這說明，PTC味盲與性別的關系不大.

2.3 不同民族PTC嘗味能力的測定

研究發現人類苯硫腺嘗味多態性有種族及民族差異，國內曾報告過一些少數民族的群體資料［10］，不同民族人群甚至同一民族在不同地區對PTC的嘗味能力不同［11］.筆者檢測的120人中有蒙古族15人，女生14人，男生僅1人，PTC嘗味能力分布域為7～10號液，分別為1，2，10，2人，平均閾值為8.8667 ±0.7180;味盲率為 0.漢族有105人，男生39人，女生66人.PTC嘗味能力分布在1，2，5，6，7，8，9，10，11，13，分別為 6，1，3，4，30，10，39，7，4，1 人，平均閾值為7.7619 ±2.2362.味盲率為13.33%，經t檢驗，t=3.52 ＞2.5，平均閾值有顯著性差異.味盲率差異極顯著.由此初步可知，蒙古族和漢族PTC嘗味能力有差別.筆者認為蒙古族起源的非均一性和歷史上蒙、漢族長期的基因交流，可能是導致這種情況的重要原因［12］.但由于蒙古族樣本容量太小，因此統計結果的可靠性有待進一步確認.

2.4 地理位置與PTC味盲的關系

據肖春杰［13］等報道，味盲基因在我國分布有明顯規律，即華南地區味盲基因頻率最低，而西北地區，尤其新疆北部地區的味盲基因頻率最高，其差異幅度相當大.PTC嘗味能力在不同地理位置分布見表1.120名大學生中，內蒙古籍學生(區內)有 72人，味盲者 13人，味盲率18.06%;省外的學生有48人，檢出味盲者1人，味盲率2.08%;區內和區外的味盲率有顯著的差異性，由于區外的同學均為東部，而內蒙古地處西部，因此，基本說明PTC味盲與地理位置有一定的關系，由于所取的樣本容量太小，不能夠有力的說明東部地區味盲率要遠比西部地區低.

2.5 群體的甚因頻率和基因型頻率

由表型判斷，群體共120人，基因型為TT的5人，Tt的為101人，tt的為14人.則群體的基因型頻率為:

TT的頻率為:P2=5/120×100%=4.17%

Tt的頻率為:2pq=101/120×100%=84.17%

tt的頻率為:q2=14/120 ×100%=11.66%

由此，T基因的基因頻率為:P=f(T)=f(TT)+1/2f(Tt)=4.17%+84.17%/2=46.255%，t基因的基因頻率為:q=1－P=1－46.255%=53.745%.

根據Hardy－Weinberg公式計算出隱性基因t的頻率為

T基因的基因頻率為p=1－q=1－34.15%=65.85%.

χ2值為 =0.17，自由度df=1，當p=0.05，查表得 χ2=3.84 ＞0.17，統計學認為在 5%顯著水平上差異不顯著，觀察數與理論數無明顯差異，即證明本群體處于遺傳平衡，且味盲基因頻率為34.15%，與鄭連斌［14］等測定的內蒙古蒙、漢兩族的PTC味盲基因頻率接近，但略微偏高，但低于莊振西［15］等測定的蒙古族、漢族和朝鮮族青少年的味盲基因頻率，更低于白人的基因頻率.

2.6 PTC酶切電泳檢測圖譜分析

對照DNA ladder Marker的指示條帶位置，查看PCR產物和酶切產物的泳道中各有幾條帶.PCR產物預期只有一條約300 bp的帶.酶切產物中如果只有一條與PCR產物同樣位置的帶，說明是tt純合體(303 bp);如果只有兩條帶，一條暗淡，在前方較遠處(64 bp)，另一條明亮比PCR產物帶稍靠前(238 bp)，說明是TT純合體;如果有三條帶，一條明亮、與PCR產物位置相同，另一條比PCR產物帶稍靠前，還有一條暗淡、在前方較遠處，則說明是Tt雜合體.下面僅展示部分PCR產物和酶切產物的電泳結果(如圖3所示)，來驗證前文PTC嘗味的結果.所有對象的基因型都得到PCR－RFLP的驗證，與由表型得到的結果基本一致.

圖3 PCR產物(左)和酶切產物(右)的電泳結果

3 小結

該調查群體中，味盲基因(t)頻率為0.3415，味盲率為11.67%，比我國平均味盲率8.28%高［16－17］，男女生味盲率分別為 15% 和 10%，二者比較差別無統計學意義，這說明，PTC味盲與性別的關系不大.但由于實驗對象來自不同的地區，又屬于不同的民族，通過計算得出PTC味盲與民族和地理位置有關.所有對象的基因型都得到PCR－RFLP的驗證，與由表型得到的結果基本一致，這就排除了由嘗味錯誤所產生的偶然誤差，使結果更可靠.

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