微生物降解枸杞中啶蟲脒農藥殘留技術的安全性評價

劉暢 郭進 劉敦華

摘要：從長期種植枸杞（Lycium barbarum L.）的土壤中分離篩選出一株可高效降解農藥啶蟲脒的細菌AC04，并制備成有效菌含量≥108 CFU/g的菌制劑。通過毒理學試驗對菌制劑的安全性進行分析，對小鼠進行菌液經口灌胃試驗、皮膚致敏試驗和大鼠30 d喂養試驗。結果表明，經口灌胃試驗小鼠的行為和進食均正常，受試物對小鼠無急性致毒作用。皮膚致敏試驗中試驗組小鼠致敏率為0，陽性對照組（給予2，4-二硝基氯苯）小鼠致敏率為100%，說明該菌制劑無皮膚致敏性。大鼠30 d喂養試驗中，試驗動物各項指標均正常，無明顯的中毒癥狀或不良反應，說明該菌制劑及其代謝產物對環境及人體無危害，可廣泛應用于果蔬等的農藥安全控制。

關鍵詞：微生物降解；啶蟲脒；枸杞（Lycium barbarum L.）；安全性評價

中圖分類號：S567；TQ450.26 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）14-3394-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.14.016

Safety Evaluation on Degradation of Acetamiprid in Wolfberry by Microbiological Agents

LIU Chang， GUO Jin， LIU Dun-hua

（Institute of Agriculture，Ningxia University，Yinchuan 750021，China）

Abstract：Adopted the approach of microorganism degrading acetamiprid in wolfberry. A kind of bacterium AC04 was sifted from the soil that was used long for planting wolfberry and made into microbiological agents，effective bacteria content was more than 108 cfu/g. The safety of the bacterium was tested by toxicology experiment. Intragastric administration was taken through mouse mouths. Sensitization of skin for mice was carried out. Rats were fed by the bacterium for thirty days. The results showed that， the lavaging experiment， mouses behavior and diet were all normal， indicated that the bacterium had no actue virulence for mice.In the skin sensitization test， the sensitization rate of mice was 0 in the experimental group and the rate was 100% on the positive control group， which indicated that the bacterium did not lead to skin sensitization. In the experiment of feeding the bacterium for thirty days， each index was normal and there was no obvious toxicity symptom or side effect. This illustrated that the the bacterium was harmless to the environment and human beings and could be applied to acetamiprid control.

Key words： microbiological degradation；acetamiprid；wolfberry（Lycium barbarum L.）；safety evaluation

隨著農田生態系統的變化，寧夏栽培枸杞的主要病蟲害也不斷發生演變，化學防治所用農藥和使用方法也隨之不斷更新，對生態環境產生了一定的不利影響。以生物修復為理論基礎的農藥殘留降解菌技術就成了降低枸杞和其生產環境中農藥殘留的一種重要手段。

本研究采用富集培養的方法，對取自寧夏長期種植枸杞土壤中的土著菌進行培養馴化，分離篩選出可降解啶蟲脒農藥的優勢菌種，并制備成有效菌含量≥108 CFU/g的菌制劑。本研究從長期種植枸杞的土壤中分離出一株巨大芽孢桿菌，對農藥啶蟲脒的降解率達到81%。與此同時，因為某些芽孢桿菌是條件致病菌，為了確保其安全性，并使菌株得到進一步應用，有必要對其進行毒理學研究。本試驗以菌懸液為受試物，對小鼠進行經口灌胃染毒試驗、皮膚致敏試驗、大鼠30 d喂養試驗，觀測動物給藥后所產生的毒性癥狀及程度、出現和消失的時間、死亡發生率、血象指標和血液生化指標，為該菌株的廣泛應用和保證食品的食用安全性提供一定依據。

1 試驗材料與儀器

1.1 受試動物

清潔級昆明種小鼠，四周齡，體重（18±2） g，雌雄各半；清潔級大鼠，四周齡，體重（75±2） g，雌雄各半。試驗動物均由寧夏醫科大學醫學動物試驗中心提供。

1.2 試劑及儀器

主要試劑：硫化鈉、2，4-二硝基氯苯、EDTA鹽均為分析純；糖化血紅蛋白檢測試劑盒購自威特曼生物科技（南京）有限公司。

主要儀器：AIRTECH型超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司）；MOL-300型全自動生化分析儀（上海艾諾電子有限公司）；SYSmesXT-1800i型全自動血球計數儀（日本希思曼公司）。

2 試驗方法

2.1 受試物樣品制備

稱取5 g菌制劑溶于500 mL去離子水中，30 ℃、200 r/min搖床培養60 min，其濃度為0.01 g/mL。

2.2 動物分組與飼養環境

試驗鼠適應性培養2～5 d，以了解其健康狀況和正常活動情況。試驗過程中保持受試環境溫度20～25 ℃，相對濕度為50%～60%，動物自由攝食和飲水。

2.3 經口灌胃染毒試驗

清潔級小鼠20只，雌雄各半，隔夜禁食16 h，不限制飲水。受試物組小鼠按最大灌胃量40 mL/kg·bw于1日內分2 次灌胃，對照組灌給等量生理鹽水，一次性給藥，然后恢復常規飲食，7 d內測定小鼠致死量并觀察小鼠以下指標：行為活動（包括不正常叫聲、煩躁、竄跑、少動等）；神經系統反應（豎毛、流淚、流涕、扭體等）；腸胃反應（腹瀉腹部脹氣或收縮大便性狀和色澤等）；皮膚顏色（充血、蒼白、發疹等）；眼（瞳孔是否縮小或放大，有無眼球突出，眼瞼下垂等）；呼吸（呼吸狀態，有無鼻分泌物等）；其他（體重變化，死亡快慢等）。

2.4 皮膚致敏試驗

將皮膚無損傷的小鼠隨機分為4組，每組10只，雌雄各半，試驗前24 h用6%的硫化鈉溶液[1]將小鼠腹部脫毛，暴露2 cm2皮膚，不損傷表皮。第一組小鼠給予降解農藥用量的一倍濃度；第二組小鼠給予降解農藥用量的兩倍濃度；第三組小鼠給予無菌生理鹽水作空白對照；第四組小鼠給予陽性致敏物（1%的2，4-二硝基氯苯），作為陽性對照。將各組處理液2 mL均勻涂于小鼠腹部皮膚上，然后用一層無刺激油紙覆蓋，再用無刺激膠帶固定，作用24 h后用溫水清洗敷貼部位皮膚，分別于1、24、48、72 h至7 d內觀察小鼠皮膚過敏反應情況。參照文獻[2]的皮膚刺激性反應評分標準及皮膚刺激性強度評價標準對觀察結果進行評分。

2.5 大鼠30 d喂養試驗

清潔級大鼠40只，雌雄各半，隨機分為4組，3組為受試物組，1組為對照組。3組受試物組分別為低劑量組（10 mL/kg·bw）、中劑量組（20 mL/kg·bw）和高劑量組（30 mL/kg·bw），每組稱取枸杞500 g，將受試物或去離子水分別噴灑于枸杞表面，無菌環境下靜置24 h待用。大鼠單籠飼養，將處理后的枸杞摻入4 kg飼料內，攪拌均勻后經飼料機制成顆粒狀，分別給4組動物飼喂，并自由攝食攝水，觀察大鼠是否出現異常行為，每周稱重1次，連續觀察30 d。喂養試驗末期，禁食12 h后頸椎拉斷法處死，心臟采血進行血象和血液生化檢查；將肝、脾、腎、睪丸取出，并剔除表面脂肪膜，稱量肝、腎、脾及睪丸的重量，計算臟體比，并進行病理組織學檢查。

2.6 大鼠血象指標測定

取加入EDTA抗凝血劑的血液于血液分析儀中測定試驗末期的常規血液指標，即紅細胞、血紅蛋白和白細胞。

2.7 血液生化指標測定

將非抗凝血5 000 r/min離心15 min，得血清，用SYSmesXT-1800i型全自動生化分析儀檢測谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、白蛋白、總蛋白、肌酐、總膽固醇、尿素氮、血糖、甘油三酯等生化指標。

3 結果與分析

3.1 經口灌胃染毒試驗結果

在觀察期內，受試物組和對照組小鼠各指標均正常，無明顯的中毒癥狀或不良反應，均無小鼠死亡。

3.2 皮膚致敏試驗結果

試驗組與對照組在誘發接觸期間皮膚刺激反應積分均為0，皮膚刺激反應平均值為0，致敏率為0，結果顯示該菌制劑對小鼠不產生皮膚變態反應，無致敏作用。陽性對照組動物在誘導接觸期間皮膚刺激反應積分均≥2分，皮膚刺激反應平均值分別為2、2、3、3、4、6、7、7分，致敏率為100%，結果顯示2，4-二硝基氯苯為極強致敏物，對受試小鼠皮膚有致敏作用，說明采用的試驗系統可靠[3，4]。

3.3 大鼠30 d喂養試驗結果

3.3.1 大鼠體征外觀、行為及體重的變化 體征外觀方面，大鼠食用含菌制劑的飼料30 d后，口周、鼻及尾部黏膜無潰瘍，呼吸平穩，背毛有光澤，眼睛紅亮，生長發育情況一切正常。行為方面，大鼠活動正常，攝食、飲水、呼吸、大小便均未見異常，亦未觀察到受試大鼠明顯異常行為和中毒癥狀。體重方面，大鼠服用受試物30 d后，體重變化見表1。由表1可知，大鼠連續食用含受試物的枸杞30 d，各劑量組大鼠體重不斷變化，每周體重較前一周均有所增長，呈現正常增長趨勢，組內自身對照各時段的體重差異具有統計學意義；組間對照，即高、中、低三個劑量組與正常對照組相比，各時段體重增長均無明顯差異，表明該菌懸液對機體生長無不良影響[5-7]。

3.3.2 血象指標 由表2可知，高、中、低3個劑量組小鼠血液學指標與對照組相比均無顯著性差異且指標正常，表明各劑量組對小鼠的血液學指標無明顯影響。

3.3.3 血液生化指標 由表3可知，所測各組大鼠末期生化指標谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、總蛋白、白蛋白、肌酐、尿素氮、甘油三酯、總膽固醇、血糖等與對照組均無顯著性差異，表明各劑量組菌制劑對小鼠的血液生化指標均無明顯影響。

3.3.4 大鼠臟器質量及臟體比 大鼠主要臟器質量及系數測定結果見表4和表5，由表4可知，對照組及低、中、高3個劑量組的大鼠肝、脾、腎、睪丸均未發生異常。由各試驗組重要臟器系數（臟器濕重/體重×100%）結果（表5）可知，各劑量組臟器系數與對照組相比無顯著性差異。

3.3.5 病理組織學檢查[6，8，9] 大鼠解剖時，觀察臟器肝、胃、腎、脾、十二指腸、睪丸、卵巢的色澤、形態、位置均無異常，臟器間無黏連、臟器表面及消化管內膜無充血、瘀血、水腫、潰瘍現象，其腹腔、胸腔與對照組相比無肉眼可見病變。

解剖后取出各臟器進一步觀察，各劑量組大鼠腎、肝、脾臟、睪丸與對照組基本一致，外觀為淡紫紅色，表面光澤油潤，各臟器組織結構均無異常改變。因此無需做進一步的組織切片觀察。綜上所述，各劑量組對動物臟器均未產生明顯影響或引起損害性改變。

4 結論

本研究中，該受試物對小鼠急性經口最大耐受劑量大于高劑量組，給藥期間小鼠無一死亡，外觀、行為、呼吸、攝食、糞便均無異常。急性皮膚刺激試驗的受試小鼠在誘導接觸期均未出現紅斑和紅腫，致敏性為0，表明菌制劑無刺激性。大鼠30 d喂養試驗結果表明，試驗期間各劑量組大鼠均未見異常癥狀和體征，無死亡，大鼠體態健康、血液生化指標無異常變化，各指標測定結果均在正常范圍內，大鼠病理組織學檢查結果未見異常，表明菌制劑噴灑于枸杞表面后其代謝物無毒性。由此可知，該菌株及代謝產物對環境及人體無危害，可廣泛應用于果蔬等的農藥安全控制。

參考文獻：

[1] 鐵 茹，劉利兵，李旭波，等.硫化鈉脫毛劑最佳脫毛濃度的探討[J]. 陜西醫學雜志，2009，38（10）：1283-1284.

[2] 衛生部藥政管理局.中藥新藥研究指南（藥學、藥理學、毒理學）[R].北京：中華人民共和國衛生部藥政管理局，1994.

[3] 李 清，牛天貴，赫華昆.馬紅球菌4-2膽固醇氧化酶的急性毒理學研究[J].肉品衛生，2005（4）：27-30.

[4] 張喜平，程琪輝，張 宇.黃芩苷膠囊小鼠急性毒性試驗[J].醫學研究雜志，2006，35（9）：16-20.

[5] 冉文華，王賢德，余成琳，等.抗癌中藥希丹液的急性毒性作用研究[J].重慶醫科大學學報，2005，30（4）：628-631.

[6] 陳 奇.中藥藥理研究方法學[M].北京：人民衛生出版社，1993.

[7] 郭沈波，郭 坤，楊志宏，等.海洋低溫溶菌酶的急性毒性試驗[J].青島大學醫學院學報，2003，39（3）：297-298.

[8] 劉勤晉，陳文品，白文祥，等.普洱茶急性毒性安全性評價研究報告[J].茶葉科學，2003，23（2）：141-145.

[9] 張均田.現代藥理實驗方法[M].北京：北京醫科大學中國協和醫科大學聯合出版社，1998.