一種基于HPLC指紋圖譜的貴州鳳岡鋅硒綠茶區(qū)別方法

李霞 譚克剛 任道援等

摘要：參照《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A）建立了基于HPLC的貴州鳳岡鋅硒茶標準指紋圖譜R，并與其他地區(qū)的同類樣品進行對比分析。結果顯示，標準指紋圖譜能夠反映出貴州鳳岡鋅硒綠茶HPLC圖譜的共性，相似度分析能明顯區(qū)分鳳岡鋅硒綠茶樣品與參比樣品（以相似度0.9進行劃分）；系統(tǒng)聚類的方法可以將貴州鳳岡鋅硒綠茶與參比樣品區(qū)分，且能反映樣品產地區(qū)別。散點圖能夠顯示鳳岡鋅硒綠茶樣品與參比樣品的區(qū)別。結果可為鳳岡鋅硒綠茶的真?zhèn)舞b別、質量評價提供參考。

關鍵詞：鳳岡鋅硒綠茶；HPLC；指紋圖譜

中圖分類號：S571.1；O657.7+2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）14-3513-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.14.047

Identification Zinc and Selenium Green Tea from Guizhou Fenggang

Based on HPLC Fingerprints

LI Xia， TAN Ke-gang， REN Dao-yuan， FENG Fa-qing， XIANG Li-ping， WANG Ao

（Institute of Product Quality Inspection & Testing of Zunyi， Zunyi 563000， Guizhou， China）

Abstract： According to the standard operating procedure of similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of TCM （Version 2004A）， the standard fingerprint R of zinc and selenium tea from Guizhou Fenggang was established based on HPLC. The results indicated that the standard fingerprint of zinc and selenium tea from Guizhou Fenggang could reflect its internal components in common. Similarity analysis clearly distinguished the zinc and selenium tea from Guizhou Fenggang from the reference samples（divided to similarity of 0.9）；System clustering method could also showed this difference and the sample origin in all samples. Scatter diagram showed a separation of zinc and selenium tea from Guizhou Fenggang in 59 samples. The results provide the reference for identification and quality evaluation of zinc and selenium tea from Guizhou Fenggang.

Key words： zinc and selenium tea from Guizhou Fenggang； HPLC； fingerprint profile

位于貴州遵義的鳳岡縣是貴州省重要的茶產區(qū)之一，其綠茶產品“鳳岡鋅硒茶”于2006年獲得地理標志產品，其特點是同時含鋅硒微量元素（其中鋅含量40～100 mg/kg，硒含量0.05～2.5 mg/kg），這一方面可提高茶葉中兒茶素的生理活性，增強其抗氧化、抗癌等保健作用[1]，另一方面也可影響茶樹生理活動，調控植株對不同物質的吸收-分配-積累[2-5]，影響到茶葉的品質、風味等，進而形成相對獨特的指紋圖譜[6-8]。

基于高效液相色譜（HPLC）的指紋圖譜方法已成為中藥研究和鑒定的主要手段[9，10]。通過指紋圖譜不但能夠全面反映中藥內在化學成分的特征和品質，還為其真?zhèn)舞b別提供了理論基礎[11-13]。目前，茶葉品鑒多依賴感官評定方法，易受評定人員主觀經驗的限制，采用儀器分析各種品質指標，由于客觀且重現性好，是茶葉真?zhèn)舞b別、品質評定的發(fā)展趨勢。本試驗以鳳岡鋅硒茶為對象，運用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》建立基于HPLC的標準指紋圖譜模型[14，15]，并對模型適用性進行分析評價[16]，以期為鳳岡鋅硒綠茶的真?zhèn)舞b別、品質分析等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

于2012-2013年，依據鳳岡富鋅富硒茶地理標志產地所界定的地域范圍，在貴州省遵義市鳳岡縣田壩隨機抽取了29個鳳岡鋅硒綠茶（Fg）樣品。所有樣品均為獨芽、依照鳳岡富鋅富硒茶加工工藝進行制作，樣品經粉碎機粉碎、過20目篩后密封備用。同時，收集了貴州其他地區(qū)，且原料、加工工藝與鳳岡鋅硒綠茶接近的綠茶樣品共23個，其來源為：銅仁9個（Tr），都勻5個（Dy），六盤水4個（Lps），湄潭5個（Mt）。所有樣品經粉碎機粉碎、過40目篩后密封備用。

1.2 儀器

1260型高效液相色譜儀（Agilent，美國）配備二極管陣列檢測器。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理 分別稱取樣品0.250 0 g，加70%（V/V）甲醇20.0 mL，經超聲處理30 min后，0.45 μm濾膜過濾，待測。

1.3.2 液相條件 色譜柱為Zorbax Eclipse Plus C18 栓（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A），0.3%（V/V）冰乙酸（B），梯度洗脫（0 min 5%A，3 min 5%A，4 min 14%A，21 min 14%A，26 min 15%A，34 min 15%A，40 min 17%A，45 min 25%A，55 min 25% A，V/V）；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；檢測波長365 nm。

1.3.3 結果計算 采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析數據，用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2004A版作圖。

2 結果與分析

2.1 標準指紋圖譜模型R

在《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2004A版中，按80%以上樣品共有峰為樣品集共有峰；參考中藥色譜指紋圖譜構建方法，以峰面積相對較大的13號峰為參照峰S，生成共有模式作為鳳岡鋅硒綠茶HPLC標準指紋圖譜模型R，如圖1所示。由圖1可知，樣品的HPLC色譜峰基線平穩(wěn)、色譜峰峰形、分離效果均較好，且不同樣品間有明顯的共有峰。

2.2 相似度分析

相似度作為指紋圖譜評價的一個參數，已被國家藥典委員會確定為中藥指紋圖譜標準中的一項重要評價指標。相似度的計算主要采用相關系數法及向量夾角余弦法。以鳳岡鋅硒綠茶標準指紋圖譜作為對照，以參比樣品色譜峰的相對保留時間和峰面積為因子，利用SPSS軟件計算52批貴州不同產地綠茶樣品HPLC數字化指紋圖譜的相關系數和向量夾角余弦，結果如表1所示。

由表1可知，利用相關系數及夾角余弦2種方式計算出的指紋圖譜的相似度均可以表示圖譜間的相似性。貴州鳳岡鋅硒綠茶HPLC對照指紋圖譜與29批貴州鳳岡鋅硒綠茶標準指紋圖譜R相似度均大于0.9，與六盤水、都勻、湄潭、銅仁等貴州其他產地綠茶相似度均小于0.9，相似度結果容易將貴州鳳岡鋅硒綠茶與貴州其他產地綠茶區(qū)分開來。

2.3 聚類分析

在相似度分析的基礎上，利用SPSS軟件對52個貴州綠茶樣品HPLC數字化指紋圖譜的全部成分進行系統(tǒng)聚類。選用歐氏距離作為樣品間相似性的測度，采用質心聚類法聚類分析，結果如圖2。由圖2可知，52個樣品系統(tǒng)聚類的結果可分為2大類：Mt1～5號、Dy1～5號、Tr1～9號和Lps3～4號綠茶為第1大類，其與貴州鳳岡鋅硒綠茶HPLC對照指紋圖譜相關系數和夾角余弦均小于0.8；第1大類又可分為2小類，Tr1～5、Tr8～9、Dy5、Mt4號綠茶為1小類，除Dy5、Mt4號外均采自貴州銅仁綠茶；Dy1～4、Tr6～7、Mt1～3、Mt5、Lps3～4號綠茶為2小類。Fg1～29號綠茶和Lps1～2號綠茶分為第2大類，其與貴州鳳岡鋅硒綠茶HPLC對照指紋圖譜相關系數和夾角余弦均大于0.8，且Fg1～29號綠茶與貴州鳳岡鋅硒綠茶HPLC對照指紋圖譜相關系數和夾角余弦均大于0.9；除Lps1～2號綠茶采自六盤水外其余綠茶均采自貴州鳳岡。經考察，Lps1～2號樣品種源來自貴州鳳岡，造成相似度大的原因可能是種源的因素。通過以上分析可知，利用系統(tǒng)聚類方法很容易將貴州鳳岡鋅硒綠茶與貴州其他地區(qū)綠茶區(qū)分開來，且可以對貴州不同產地綠茶進行歸類。

2.4 主成分及二維排序分析

利用SPSS軟件的主成分分析函數分析52個樣品，結果見表2和表3。通過對主成分貢獻的分析可知，由于茶葉內含成分較多，對茶葉品質的影響因素不是單一的，此色譜條件下測定的貴州綠茶指紋圖譜茶葉主成分達到了3個。PC1～PC3的貢獻率分別為69.621%、13.001%、6.9765%，累計貢獻率為89.587%，其他成分的貢獻率相對較小，從累計貢獻率來看，根據主成分分析原理，取前3個為主要成分足可以說明各指標信息。由特征向量表（表3）可以看出，PC1主要反映了原始圖譜的3號、5號、8號和13號色譜峰的信息，PC2主要反映了原始圖譜的6號、7號、10號和15號色譜峰的信息。

以52個樣品的第1主成分作縱坐標，以第2主成分為橫坐標，利用SIMCA-P+12軟件作成散點圖（圖3），由散點圖可以直觀顯示出貴州鳳岡鋅硒綠茶樣品與貴州其他產地綠茶樣品不同。Fg1～29號綠茶均采自貴州鳳岡，品質相近，在散點圖上基本聚在一起，且與采自貴州其他產地的綠茶在散點圖上相距較遠。貴州其他產地的綠茶除Lps1～2號、Dy5號及Mt4號綠茶外，在散點圖上也基本聚集在一起。

3 小結

以HPLC為基礎，用二極管陣列檢測器（DAD）在365 nm處分析，能夠獲得鳳岡鋅硒茶樣品內含物特征及其與參比樣品的差異。經方法基線平穩(wěn)，且總體峰面積較大，操作簡單、重復性好。相似度分析、聚類分析、主成分均顯示所建立的鳳岡鋅硒綠茶標準指紋圖譜R有相對獨特的特征，可為相關研究提供參考。

參考文獻：

[1] 趙保路.茶多酚的抗氧化作用[J].科學通報，2002，47（16）：1206-1210.

[2] 王小平，劉 鵬，羅 虹，等.鋁氟交互處理對茶葉品質的影響[J].茶葉科學，2009，29（1）：9-14.

[3] 王小平，劉 鵬，羅 虹，等.鋁氟交互處理對茶樹生理特性的影響[J].園藝學報，2009，36（9）：1359-1364.

[4] 夏建國，蘭海霞，吳德勇.鉛脅迫對茶樹生長及葉片生理指標的影響[J].農業(yè)環(huán)境科學學報，2010，29（1）：43-48.

[5] 唐 茜，趙先明，杜 曉，等.氟對茶樹生長、葉片生理生化指標與茶葉品質的影響[J].植物營養(yǎng)與肥料學報，2011，17（1）：186-194.

[6] 王麗鴛，成 浩，周 健，等.綠茶數字化多元化學指紋圖譜建立初探[J].茶葉科學，2007，27（4）：335-342.

[7] 成 浩，王麗鴛，周 健，等.基于化學指紋圖譜的綠茶原料品種判別分析[J].中國農業(yè)科學，2008，41（8）：2413-2418.

[8] 楊曉莉，王聰慧，李菊華，等.HPLC法測定不同年份下關沱茶咖啡因的含量[J].安徽農業(yè)科學，2010，38（31）：17463-17464.

[9] 沙 明，王嘉仡，曹愛民，等.HPLC指紋譜技術在中藥新藥質量控制中的應用[J].中草藥，2002，33（2）：87-89.

[10] 沙 明，張東方，孟憲生，等.DNA指紋譜與HPLC指紋譜對中藥地榆質量評價研究[J].中國藥學雜志，2002，37（11）：15-18.

[11] 陳閩軍，瞿海斌，程翼宇.一類用化學指紋特征鑒別中藥材真?zhèn)蔚姆椒╗J].高等學校化學學報，2003，24（12）：2181-2185.

[12] 陳閩軍，吳永江，范驍暉，等.色譜指紋圖譜分析技術用于鑒別中藥川芎產地[J].中國中藥雜志，2003，28（7）：23-27.

[13] 陶金華，狄留慶，文紅梅，等.中藥指紋圖譜譜效相關性研究思路探討[J].中國中藥雜志，2009，34（18）：2410-2413.

[14] 程翼宇，陳閩軍，吳永江.化學指紋圖譜的相似性測度及其評價方法[J].化學學報，2002，60（11）：2017-2021.

[15] 馮啟余，曹玉華，龔立冬.中藥指紋圖譜共有峰的自動識別[J].分析科學學報，2009，25（1）：41-46.

[16] 陳全勝，趙杰文，張海東，等.SIMCA模式識別方法在近紅外光譜識別茶葉中的應用[J].食品科學，2006，27（4）：186-189.