羊種布魯氏菌NN1202和LA1105株OPM25和OPM31蛋白B細胞抗原表位分析

李軍+李常挺+潘艷等

摘要： 應用PCR技術對羊種布魯氏菌NN1202和LA1105株的[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因進行擴增、克隆和測序。測序結果顯示，NN1202和LA1105株的[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因在布魯氏菌種間高度保守。應用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法分析OMP25和OMP31蛋白的α-螺旋、β-折疊、轉角區域和卷曲區域；應用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法分析蛋白的氨基酸親水性、蛋白柔性區域、溶劑表面可及性和抗原指數。對各方法的結果綜合分析，OMP25蛋白的27～34、59～65、69～75、101～107、148～154、182～189、197～202區域以及OMP31蛋白的25～32、50～58、63～70、102～111、125～130、166～173、176～183區域可能是優勢B細胞抗原表位。

關鍵詞： 布魯氏菌；OMP25；OMP31；抗原表位

中圖分類號： S858.26 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0038-04

布魯氏菌是一種感染人、家畜、野生動物等60多種動物的人獸共患病原菌，根據宿主和致病性的差異，分為羊種布魯氏菌（Brucella melitensis）、牛種布魯氏菌（B. abortus）、豬種布魯氏菌（B.suis）、綿羊附睪種布魯氏菌（B. ovis）、犬種布魯氏菌（B. canis）和沙林鼠種布魯氏菌（B. neotomae）6個種；此外，還從海洋動物中分離到在致病性和分子特征上有別于前6種的海豚布魯氏菌（B. cetacease）和海豹布魯氏菌（B. pinnipediae） [1]。在這8種布魯氏菌中，以羊種布魯氏菌對人的致病性最強。布魯氏菌的外膜由外膜蛋白、脂多糖和磷脂層構成。外膜蛋白為一類與毒力密切相關的免疫原性蛋白 [2-3]，其中，分子量分別為25 ku（OMP25）和31 ku（OMP31）的2種外膜蛋白是布魯氏菌的主要外膜蛋白 [4-5]。OMP25蛋白和OPM31蛋白免疫小鼠后，能分別誘導產生IgG2a 和IgG1類型的抗體，是一種抗原免疫保護蛋白 [6-7]。Bowden等證實OMP31的單克隆抗體與其誘導產生的抗體存在競爭抑制現象，表明OMP31存在抗原表位 [8]。本研究擬對廣西分離的2株羊種布魯氏菌NN1202、LA1105菌株的[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因進行克隆、測序，運用生物信息學技術對二者的B細胞抗原表位進行分析，為后續的合成肽疫苗研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 羊種布魯氏菌NN1202和LA1105菌株由廣西獸醫研究所細菌研究室分離、鑒定和保存 [9]。羊種布氏菌5號疫苗為PCR擴增陽性對照菌株。

1.1.2 試劑 布氏瓊脂粉購自英國Oxiod公司；馬血清購自美國Thermo公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒及PCR反應所用試劑購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1OMP25和OMP31 基因的PCR擴增和克隆 取保存的羊種布魯氏菌NN1202株和LA1105株凍干菌種，每支菌種加入0.2 mL無菌水溶解，接種棒蘸取菌液接種于含10%馬血清布氏瓊脂斜面培養基，置于37 ℃的CO2培養箱培養 72 h。用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌DNA，以細菌DNA為模板對[WTBX][WTBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因進行PCR擴增。以羊種布氏菌5號疫苗為陽性對照。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，60 ℃（57 ℃） 1 min，72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃ 10 min。擴增預期片段分別為650 bp和750 bp。引物序列分別為PM25-F：5′-GAATTCATGCGCACTCTTAAGTCTCTC-3′；OPM25-R：5′-GTCGACTTAGAACTTGTAGCCGATGCC-3′；OPM31 -F：5′-GCGAATTCATGAAGTCCGTAATT-3′；OPM31-R：5′-GCCTCGAGTTAGAACTTGTAGTT-3。引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

DNA膠回收試劑盒純化、回收目的片段后，與pMD-18T載體4 ℃過夜連接，轉化大腸桿菌DH5α，PCR鑒定正確的陽性克隆送上海英駿生物技術有限公司測序。

1.2.2 OMP25和OMP31基因的核苷酸同源性分析 應用MegAlign軟件對測序獲得的OMP25和OMP31基因的核苷酸序列與GenBank上登錄的已知序列進行同源性比較，分析它們之間的親緣關系。

1.2.3 OMP25蛋白和OMP31蛋白二級結構分析 運用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法分析OMP25蛋白和OMP31蛋白的α-螺旋、β-折疊、轉角區域和卷曲區域 [10-11]。

1.2.4 OMP25蛋白和OMP31蛋白B細胞抗原表位分析 應用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法分析OMP25蛋白和OMP31蛋白的氨基酸親水性、蛋白柔性區域、溶劑表面可及性和抗原指數，綜合各方法的結果并結合B細胞表位網上預測（http：//www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/）來分析OMP25蛋白和OMP31蛋白的B細胞抗原表位 [12-15]。

2 結果與分析

2.1OMP25和OMP31基因的PCR擴增

提取羊種布魯氏菌NN1202株和LA1105株的DNA，分別對OMP25和OMP31 [STBZ]基因進行PCR擴增，得到650 bp和750 bp的擴增片段，大小與陽性對照羊種布魯氏菌5號疫苗的擴增結果一致（圖1）。

2.2 OMP25和OMP31 基因的核苷酸同源性分析

NN1202株和LA1105株的陽性OMP25質粒測序后證實擴增片段大小為650 bp，內含1個642 bp的開放閱讀框，編碼213個氨基酸，它們的核苷酸序列已登錄GenBank，登錄號分別為KJ720202和KJ720201。將它們的核苷酸序列與GenBank登錄的相應序列進行同源性比較，NN1202株和LA1105株OMP25之間的同源性為100%，與羊種布魯氏菌M5-90（CP001852）、豬種布魯氏菌S2（CP006961）、牛種布魯氏菌S19（CP000887）、犬種布魯氏菌ATCC23365（CP000872）、綿羊附睪種ATCC25840（CP000708）的同源性均為100%。

NN1202株和LA1105株的陽性OMP31 質粒測序后證實擴增片段大小為750 bp，內含1個723 bp的開放閱讀框，編碼240個氨基酸，它們的核苷酸序列已登錄GenBank，登錄號分別為KJ720203和KJ720204。將它們的核苷酸序列與GenBank登錄的相應序列進行同源性比較，NN1202株、LA1105株和羊種布魯氏菌M5-90（CP001852）[OMP25 之間的同源性均為100%；與豬種布魯氏菌S2（CP006961）、犬種布魯氏菌ATCC23365（CP000872）、綿羊附睪種ATCC25840（CP000708）的同源性為99%。

2.3 OMP25蛋白和OMP31蛋白二級結構分析

綜合Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法的分析，OMP25蛋白有4個α-螺旋區域（13～29、75～79、100～104、109～114），9個β-折疊區域（6～10、49～55、62～67、86～91、130～144、154～159、173～181、190～196、204～207）。在α-螺旋和β-折疊區域的間隙分布著長短不一的13個轉角區域和11個卷曲區域（圖2）。OMP31蛋白有4個α-螺旋區域（4～21、121～134、144～145、172～176），9個β-折疊區域（22～25、75～77、82～88、97～102、112～115、135～139、147～152、156～163、230～240）。在α-螺旋和β-折疊區域的間隙分布著長短不一的17個轉角區域和12個卷曲區域（圖3）。

2.4 OMP25蛋白和OMP31蛋白的氨基酸親水性分析

Kyte-Doolittle方法分析表明，OMP25蛋白有較多的親水[CM（25]性區域（≥0.5），分布較為均勻，主要有27～32、44～46、

2.5 OMP25蛋白和OMP31蛋白的柔性區域分析

2.6 OMP25蛋白和OMP31蛋白的溶劑表面可及性分析

Emini方法分析表明，59～63、70～75、101～107、177～189和196～202區域出現在OMP25蛋白溶劑表面可及性較大（≥1）（圖8）。OMP31蛋白的溶劑表面可及性區域較少，只有2個區域（63～69和177～182）（圖9）。

2.7 OMP25蛋白和OMP31蛋白的抗原指數分析

Jameson-Wolf方法分析表明，OMP25蛋白抗原指數較高的區域（≥0）有：26～33、56～65、68～75、93～99、101～105、117～127、143～156、165～179、183～190、195～207，以C端區域的抗原指數較高，跨度較大，存在抗原表位的可能性也較大（圖10）。OMP31蛋白抗原指數較高的區域（≥0）分布較均勻，以23～33、51～75、102～111、118～130、136～147、167～173、177～184和206～227區域存在抗原表位的可能性較大（圖11）。

2.8 OMP25蛋白和OMP31蛋白B細胞表位綜合分析

應用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法并結合B細胞表位網上預測分析（http：//www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/），OMP25蛋白的27～34、59～65、69～75、101～107、148～154、182～189、197～202[CM（21*2/3]區域以及OMP31蛋白的25～32、50～58、63～70、

102～111、125～130、166～173、176～183區域均具有較好的親水性、柔性和溶劑表面可及性，抗原指數也較高，結合蛋白二級結構上含有容易形成抗原表位的轉角和卷曲區域，因此，這些區域極有可能是OMP25蛋白和OMP31蛋白的優勢B細胞抗原表位。

3 討論

研究證實，布魯氏菌[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 基因是免疫原性基因，它們編碼的蛋白對小鼠具有免疫保護作用 [6-7]。本研究對羊種NN1202株和LA1105株[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 基因核苷酸同源性比較結果表明，[OMP25和OMP31 基因在布魯氏菌種間高度保守，OMP25和OMP31蛋白可以作為布魯氏菌合成肽疫苗的候選靶蛋白。

利用生物信息學技術對病原微生物的抗原蛋白二級結構和B細胞抗原表位進行分析是研制合成肽疫苗的基礎 [16]。研究表明，B細胞抗原表位的形成取決于蛋白二級結構的形成。蛋白在形成立體構象時，多肽鏈中的α-螺旋和β-折疊的氫鍵鍵能高，形成穩定的剛性結構，在蛋白內部中起著“骨架”作用，不易與抗體結合，成為B細胞抗原表位的幾率低。相反，轉角和卷曲區域的氫鍵鍵能低，形成盤旋、扭曲等松散的柔性結構暴露在蛋白表面，與抗體結合的幾率大，成為B細胞抗原表位的可能性高 [17]。此外，氨基酸的親水性、極性也決定了其是否暴露在蛋白表面，因此，蛋白的親水部位和溶劑表面可及性也與B細胞抗原表位有密切關系。

B細胞抗原表位的分析方法主要有蛋白二級結構分析、氨基酸親水性分析、蛋白柔性區域分析、溶劑表面可及性分析 [10-14]。Jamson等將上述4種方法綜合，以蛋白二級結構分析占40%、氨基酸親水性分析占30%、蛋白柔性區域分析占15%、溶劑表面可及性分析占15%的計算模式，提出一種抗原指數分析法 [15]。根據該方法分析，發現OMP25蛋白的26～33、56～65、68～75、93～99、101～105、117～127、143～156、165～179、183～190、195～207區域以及OMP31蛋白的23～33、51～75、102～111、118～130、136～147、167～173、177～184和206～227區域存在抗原表位的可能性較大，但由于蛋白在形成立體構象時，蛋白表面的氨基酸會遮蓋一些抗原指數較高的區域，使其不能成為優勢抗原表位，因此，根據綜合分析，筆者選擇OMP25蛋白的27～34、59～65、69～75、101～107、148～154、182～189、197～202區域以及OMP31蛋白的25～32、50～58、63～70、102～111、125～130、166～173、176～183區域作為后續合成肽疫苗研究的靶位點。

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