DNA分子復制過程中的引物相關知識補充

劉學廷

摘 要 DNA分子復制需要引物，體內DNA分子復制需要RNA作為引物，復制結束后將引物切除，并通過相關酶補齊引物切除后留下的空隙；DNA體外擴增時需要DNA引物，復制結束時不需要切除引物，但對DNA引物設計和合成提出了較高的要求。

關鍵詞 RNA引物 DNA引物 引物切除 引物設計

中圖分類號 Q-49 文獻標志碼 E

近幾年，有關“引物”的題目頻繁地出現在各地調研題和高考題中，而現有高中生物教材中只提及PCR需要引物，而引物是什么？引物從哪兒來？引物的作用是什么？為什么需要引物？是否所有DNA復制都需要引物？如何切除引物？……這些相關知識在教材中并沒有提及。為了對“引物”有較全面的了解，下面參考有關資料，對引物相關知識作概括和補充。

1 引物的涵義

DNA分子復制不能從頭開始，必須從一段已經存在的核苷酸鏈上延伸，這一段核苷酸序列就是引物，又稱“引子”。在生物體內，DNA分子復制所需引物主要是一小段RNA分子，但如果在體外進行DNA擴增，引物一般是一小段人工合成的DNA分子。

DNA每一次復制時一般需要兩個引物，一個引物與DNA一條DNA模板鏈一端互補，另一個引物與另一條DNA模板鏈的另一端互補。

少數DNA分子復制時不需要引物，某些病毒如M13噬菌體內的DNA為單鏈環狀DNA分子，可通過滾環方式進行復制：M13噬菌體進入大腸桿菌后，先形成復制型雙鏈環狀DNA分子，然后在M13噬菌體的雙鏈DNA環狀分子一條鏈（正鏈）上切一個切口，產生游離的3′-羥基作為延伸起點，最后在宿主細胞DNA聚合酶III的催化下，以另一條單鏈即負鏈為模板不斷地合成新的正鏈（圖1）。此過程不需要新的引物，直接以原有正鏈的切口處3′-羥基為引物連接上新的脫氧核苷酸。

2 DNA分子復制時需要（RNA）引物的原因

無論體內還是體外，DNA的復制均需要DNA聚合酶，但DNA聚合酶必須從一小段已存在的核酸（DNA或RNA）開始，把新的核苷酸添加到該段核酸的3′-OH上，也就是說DNA聚合酶只能延長一段核酸鏈的3′端，而引物就提供了這段核酸鏈的3′-OH，所以DNA分子復制時需要引物。

大多數DNA分子復制時引物為什么是一小段RNA而不是DNA，這主要與DNA分子復制具有高度的忠實性有關：在DNA分子復制剛剛開始的時候，最初加入的核苷酸難以與模板形成穩定的雙螺旋結構，導致堿基很容易發生錯配，從而產生變異，而DNA原有的校正系統難以識別這一小段核苷酸序列，這不利于DNA分子的穩定性。但如果用RNA做為引物，即使出現差錯也不要緊，因為DNA聚合酶可識別這些異常的核苷酸序列并將引物切除，從而保證了DNA分子結構的穩定性。另外，RNA聚合酶以DNA為模板合成RNA不需要引物，所以在體內合成RNA引物比DNA引物更容易。

若在體外進行DNA分子擴增，則以一對已知序列的DNA片段作為引物。一個標準的PCR反應系統包括：DNA模板、耐熱的DNA聚合酶（如Taq酶）、一對引物、4種dNTP、合適的Mg2+和一定體積的緩沖液等。由于PCR反應系統不能切除RNA引物，這不利于DNA分子結構的穩定。而體內DNA復制時，有專門的酶將RNA引物切除。另外，體外DNA復制所需引物需人工合成，無論是序列的測定還是合成，DNA片段較RNA片段更容易。

3 復制后“引物”的切除與補齊

DNA分子體內復制所需引物主要是一小段RNA，RNA引物只是啟動DNA復制，但在復制結束后，引物必須切除，否則混雜RNA片段的DNA分子影響其結構的穩定，也影響遺傳信息的傳遞與表達。在原核細胞內，切除RNA引物的酶是DNA聚合酶I或核糖核酸酶H，其中DNA聚合酶I既有5′→3′方向延伸脫氧核苷酸鏈功能，還具有5′→3/和3′→5/外切核酸酶的活性，所以DNA聚合酶I憑借5’-外切酶的活性切除總是位于5′端的RNA引物。核糖核酸酶H是一種特殊的內切核酸酶，專門水解與DNA雜交的RNA，包括RNA引物，如T4噬菌體DNA復制中引物的切除，也可通過宿主細胞的DNA聚合酶I切除。而真核細胞的任何一種DNA聚合酶均沒有5/-外切酶活性，因此負責切除RNA引物的酶主要是核糖核酸酶H。切除后的DNA片段由DNA連接酶連接在一起形成連續的DNA鏈。如果是體外DNA復制，由于引物是DNA片段，所以不需要切除引物。

當真核細胞的線型DNA復制到最后，位于末端的RNA引物被切除后，會留下一段空隙得不到補充，長期下去，末端DNA就會越來越短。因此必須填補末端RNA引物被切除后留下的空隙，這個過程主要靠端聚酶來完成，端聚酶由蛋白質和RNA兩種成分組成，其中蛋白質具有反轉錄酶的活性。具體過程如下：首先是以端聚酶中的RNA為模板，在端聚酶中的反轉錄酶的作用下，合成DNA片段，從而延伸線型DNA一條鏈的3′端，然后再以延伸的DNA片段為模板，合成新的岡崎片段，最終填補RNA引物被切除后留下的空隙（圖2）。

如果是其他類型的線型DNA，如某些噬菌體的線型DNA、某些真核細胞病毒的線型DNA等，它們的引物被切除后留下的空隙可通過將線型DNA暫時轉變為環形DNA，或通過滾環復制等方式解決。

4 “引物”的設計

體內DNA復制所用引物一般為RNA片段，在復制結束后被切除，而體外擴增DNA使用的是DNA引物，在DNA擴增結束后不被切除，這就對引物有了極高的要求。

在體外合成DNA引物時要注意以下幾點：① 引物的長度一般為15～30 bp（堿基對），其有效長度（是指與模板配對的引物長度，不包括5′末端添加的序列）一般不大于38 bp，否則PCR的最適延伸溫度會超過Taq酶（耐高溫的DNA聚合酶）的最佳作用溫度（74度），從而降低產物的特異性。當然引物的長度也不能過短，否則會增加錯配現象。② G和C的含量應在40%～60%之間，引物G和C的含量過低，會導致PCR過程中退火溫度較低，不利于提高PCR的特異性，但G和C的含量過高也易于引發非特異擴增。③ 引物堿基盡可能隨機分布，應避免連續出現4個以上的單一堿基，尤其是不應在其3′端出現超過3個的連續G或C，否則會使引物在G+C富集序列區錯誤引發。另外，引物上游和下游引物的G和C的含量最好相近，不能相差太大。④ 引物自身不能含有互補序列，否則會形成發夾樣二級結構，導致引物不能和模板結合。兩個引物之間不應有多于4個的互補或同源堿基，不然會形成引物二聚體。⑤ 引物3′端最后一個堿基應嚴格與模板互補配對，否則影響PCR擴增效率。⑥ 引物3′端最后一個堿基應選在密碼子的第一個或第二個核苷酸上。由于堿基擺動，大多數密碼子具有簡并性，編碼同一個氨基酸的密碼子第三個堿基可以有差異。⑦ 引物3′端最后一個堿基最好選擇G或C，不選A。有資料表明，當末位為T時，即使在錯配的情況下也能引發鏈的合成，而末位為A時，錯配時引發率大大降低，而當末位堿基為T時，錯配的情況下也能引發的合成，當末位堿基為G、C時錯配的引發率居中。因此，應盡量避免引物3′端的第一位堿基是A，引物3′端最佳堿基的選擇是G和C，因為它們形成的堿基配對比較穩定。

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