山楂葉總黃酮對血管性癡呆大鼠學習記憶的干預作用及機制

吳曉光 李 玲 苗光新 趙淑敏 檀榮方 曹 慧

(承德醫學院基礎醫學研究所，河北 承德 067000)

慢性腦供血不足是引起血管性癡呆(VD)最常見的原因之一。腦組織缺血缺氧可引起神經細胞變性、壞死、凋亡及膠質細胞腫脹增生。乙酰膽堿(Ach)是與學習記憶最為密切相關的神經遞質〔1〕，海馬組織內Ach含量持續性減少是VD發生、發展的主要原因〔2〕。山楂葉總黃酮(TFHL)是從山楂樹葉中提取分離的黃酮化合物〔3〕，主要成分為蘆丁、牡荊素、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、槲皮素和金絲桃苷等〔4〕。TFHL制劑(益心酮)具有降血壓、降血脂、強心、抗心肌缺血〔5〕、提高腦組織抗氧化〔6，7〕等多方面的作用，在心血管疾病方面療效肯定，臨床已得到廣泛應用，但其對VD的學習記憶障礙是否具有保護作用尚不清楚。本研究觀察TFHL對VD模型大鼠學習記憶能力、神經元形態密度、神經膠質酸性蛋白(GFAP)的表達及海馬組織內乙酰膽堿酯酶(AChE)和乙酰膽堿轉移酶(ChAT)活性的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 成年雄性清潔級SD大鼠，60只，體質量(260±20)g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證號:scxk(京)2006-2009。飼養于承德醫學院二級實驗動物中心，室溫維持在18～24℃，相對濕度(40～60)%，自然光照，自由進食進水。適應1 w，大鼠隨機分為假手術組、模型組、TFHLⅠ、Ⅱ、Ⅲ組，每組12 只。

1.2 藥物 TFHL購于山西振東泰盛制藥有限公司，純度98%。用前蒸餾水溶解，濃度為10 mg/ml。

1.3 試劑與儀器 GFAP抗體、3，3-二氨基苯聯胺(DAB)試劑盒，SABC免疫組化試劑盒(博士德生物科技有限公司)，AChE、ChAT試劑盒(南京建成生物工程有限公司)，Morris水迷宮視頻分析系統(中國醫學科學院藥物研究所)，分光光度計(上海京工實業有限公司)。

1.4 模型制備及給藥 模型組、TFHLⅠ、Ⅱ、Ⅲ組制備VD模型:30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，頸部正中矢狀切口，鈍性分離皮下組織及筋膜，在頸動脈三角處游離出雙側頸總動脈，結扎并切斷雙側頸總動脈，縫合切口，術后24 h內未蘇醒者剔除，并及時補遺。假手術組除不結扎雙側頸總動脈外，其余操作同其他各組。大鼠蘇醒后，每只注射1次青霉素預防感染。術后第 14天，TFHLⅠ、Ⅱ、Ⅲ組分別給 TFHL 70、140、280 mg·kg－1·d－1灌胃，連續36 d。假手術組及模型組給予等體積生理鹽水。

1.5 Morris水迷宮實驗 定位航行實驗:在造模前第4天將大鼠依次放入Morris水迷宮進行適應性游泳訓練1次，共計60 s，不放平臺，不記錄成績。在造模前第3天和第2天，將平臺放入任一象限中央，進行定位航行實驗，用于檢測大鼠間是否存在學習記憶障礙:將大鼠從A、B、C、D 4個入水點面向池壁依次放入水中，觀察在60 s內大鼠找到并爬上平臺所用的時間(逃避潛伏期)，若60 s內未能找到平臺，則將其引導到平臺并在平臺上停留15 s，潛伏期記為60 s。給藥第30天，再將大鼠依次放入Morris水迷宮進行適應性游泳訓練1次，共計60 s，不放平臺，不記錄成績。給藥第31天，開始進行定位航行實驗，用于檢測大鼠對空間記憶的獲得能力，每天1次，共6 d。

空間探索實驗:用于檢測大鼠對平臺區域的準確記憶能力，第6天，定位航行實驗結束后，撤去平臺，由第Ⅱ象限入水點面向池壁放入大鼠，觀察大鼠在60 s內穿越平臺區域的次數及平臺象限游泳路程百分比。

1.6 病理學及免疫組化檢測 行為學實驗結束后，每組隨機選取6只，30 mg·kg-1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛左心室插管灌注固定，取腦組織常規石蠟包埋，5 μm連續冠狀切片，每隔3片選取1張切片。常規HE染色，光鏡觀察海馬神經元形態及密度，并用MiVnt病理圖形分析系統計算神經元密度及細胞脫失率。免疫組化法檢測GFAP的表達，具體步驟按試劑盒說明書進行，光鏡下觀察GFAP的表達情況，利用MiVnt病理圖形分析系統進行圖像分析。

1.7 海馬組織AChE、ChAT活性檢測 行為學實驗結束后，將每組余下的6只大鼠在冰臺上斷頭取腦，分離出海馬組織，4℃生理鹽水沖洗殘留血液，分析天平稱重，加入9倍體積的預冷生理鹽水，組織勻漿器勻漿，按試劑盒說明書測定AChE、ChAT活性。

1.8 統計學方法 應用SPSS17.0軟件行one-wayANOVA方差分析，方差齊用LDS檢驗，方差不齊用Games-Howell檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠定位航行能力的變化 各組大鼠逃避潛伏期及尋找平臺游泳路程無顯著差異(P＞0.05)。術后大鼠定位航行實驗結果顯示:與假手術組比較，模型組大鼠逃避潛伏期延長，尋找平臺游泳路程明顯延長(P＜0.01);TFHL各組藥物干預后，TFHLⅠ組大鼠的逃避潛伏期及尋找平臺游泳路程已明顯縮短(P＜0.05)TFHLⅡ、Ⅲ組優于Ⅰ組(P＜0.05)，TFHLⅡ、Ⅲ組之間無顯著性差異(P＞0.05)，見圖1，表1。

2.2 各組大鼠空間探索能力的變化 模型組的大鼠在60s內穿越平臺區次數減少，與假手術組比較平臺象限游泳路程百分比明顯降低(P＜0.01);TFHL各組藥物干預后，TFHLⅠ組大鼠穿越平臺區次數增多，平臺象限游泳路程百分比顯著增加(P＜0.05)，TFHLⅡ、Ⅲ組優于Ⅰ組(P ＜0.05)，TFHLⅡ、Ⅲ組之間無顯著性差異(P＞0.05)，見圖2，表1。

2.3 各組大鼠海馬CA1區神經元形態及密度的變化 HE染色顯示，假手術組海馬CA1區神經元排列整齊，可見3～4層細胞，染色均勻，細胞核大而圓，染色淺，核仁清晰;模型組大部分神經元變性壞死，排列紊亂，細胞周圍間隙加大，細胞核濃縮、深染、溶解、消失，細胞胞質結構不清，神經元密度顯著降低;與模型組比較，TFHL各組病變明顯減輕，正常神經元數量明顯增多，排列稍規則，結構較清晰，神經元密度顯著增多(P＜0.05，P＜0.01)，TFHLⅡ、Ⅲ組優于Ⅰ組(P ＜0.05)，TFHLⅡ、Ⅲ組之間無顯著差異(P＞0.05)，見表1。

圖1 各組大鼠定位航行能力的變化

圖2 各組大鼠空間探索能力的變化

表1 各組大鼠定位航行能力、空間探索能力、CA1區神經元密度及神經元脫失率的比較(±s，n=12)

表1 各組大鼠定位航行能力、空間探索能力、CA1區神經元密度及神經元脫失率的比較(±s，n=12)

與假手術組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01，下表同

組別 逃避潛伏期(s)游泳距離(m) 穿越平臺次數 平臺象限游泳距離百分比神經元密度(mm2)神經元脫失率(%)0.5376.43±9.260模型組 19.54±6.121) 3.6502±0.62311) 3.96±1.341) 33.42±5.321) 38.74±8.351) 48.47±6.121)TFHL Ⅰ組 13.43±2.792) 2.3912±0.46822) 5.92±1.982) 43.68±6.142) 46.62±5.482) 17.64±4.382)TFHL Ⅱ組 10.01±2.853) 2.0044±0.32193) 6.17±2.123) 48.22±7.393) 54.93±2.632) 14.67±3.803)TFHL Ⅲ組 9.14±2.943) 1.8302±0.39683) 7.22±2.233) 49.56±7.463) 56.26±6.232) 14.32±3.563)假手術組 5.86±2.431.1302±0.3614 12.40±4.2669.43±1

圖3 各組大鼠腦組織GFAP表達的變化(DAB，×400)

2.4 各組大鼠腦組織GFAP的表達變化 免疫組化染色顯示:假手術組星形膠質細胞GFAP表達弱陽性，位于胞質內，細胞陽性突起較小;模型組表達數量增多，胞體腫脹，突起增粗，呈強陽性;TFHL各組藥物干預后，GFAP表達明顯減少，胞體腫脹減輕(P＜0.05，P＜0.01)，TFHLⅡ、Ⅲ組優于Ⅰ組(P ＜0.05)，TFHLⅡ、Ⅲ組之間無顯著差異(P＞0.05)，見圖3，表2。

2.5 各組大鼠海馬AchE、ChAT活性的變化 分光光度比色法顯示:模型組大鼠海馬組織內AchE活性升高，ChAT活性降低，與假手術組比較有極顯著差異(P＜0.01);TFHL各組藥物干預后，AchE活性降低，ChAT活性升高，與模型組比較有顯著差異(P＜0.05)，TFHLⅡ、Ⅲ組優于Ⅰ組(P＜0.05)，TFHLⅡ、Ⅲ組之間無顯著差異(P＞0.05)，見表2。

表2 各組大鼠腦組織GFAP表達、ChAT、AchE活性變化的比較(±s，n=6)

表2 各組大鼠腦組織GFAP表達、ChAT、AchE活性變化的比較(±s，n=6)

0.14±0.08226.83±39.760.66±0.17模型組 3.46±0.891) 119.84±46.521) 1.32±0.351)TFHL Ⅰ組 1.56±0.562) 155.34±39.612) 0.94±0.282)TFHL Ⅱ組 1.07±0.263) 179.63±38.263) 0.84±0.193)TFHL Ⅲ組 0.93±0.173) 186.53±37.793) 0.82±0.233)GFAP ChAT AchE假手術組組別

3 討論

VD主要表現為記憶、認知功能缺損，嚴重影響著患者的身心健康。海馬是參與學習記憶功能的主要腦區，與海馬膽堿能系統密切相關〔8〕。海馬血供單一，少有側支循環，對缺血缺氧極為敏感。有證據表明，缺血導致海馬CA1區神經元脫失是VD的主要病理基礎〔9〕。本文結果顯示:TFHL各組藥物干預后，海馬CA1區神經元形態恢復正常，密度增加，學習記憶能力明顯提高，說明TFHL可保護神經元、減少海馬CA1區神經元脫失，改善VD大鼠學習記憶障礙。

星形膠質細胞是腦組織中數量龐大的一組非神經元細胞，對神經元起支持、保護、營養作用。GFAP是星形膠質細胞特異性標志蛋白，其表達量的多少可以反映星形膠質細胞的功能狀態。國內外研究發現，炎癥反應在VD的發生與發展中起到一定的作用〔10〕。VD病腦內存在異常激活的星形膠質細胞，這些被激活的星形膠細胞釋放一些毒性因子參與了VD的發病過程，抑制星形膠質細胞活化，可減輕VD大鼠的學習記憶能力〔11〕。本實驗結果顯示:TFHL各組海馬組織內星形膠質細胞GFAP表達明顯減少，胞體腫脹減輕，說明TFHL藥物對腦缺血的保護作用機制可能與其抑制腦缺血后GFAP過度活化，減少星形膠質細胞釋放炎癥因子有關。

Ach是中樞膽堿能神經系統重要的神經遞質，在腦組織內廣泛分布，與學習記憶功能密切相關。ChAT是合成Ach的關鍵酶，主要存在于膽堿能神經元內，在胞體內合成，通過軸突運輸到神經末梢的胞質中，是衡量Ach能神經元功能的主要標志〔12〕。AChE的作用是分解 Ach，與 ChAT共同調節 Ach的動態平衡。研究發現VD患者腦組織內乙酰膽堿含量減少，ChAT的活性降低，膽堿能神經的信息傳遞中斷，造成動物獲得性記憶障礙〔13〕。另有實驗表明大鼠腦缺血后，VD含量降低，給予擬膽堿能藥物能增強ChAT的活性，增加腦組織內VD含量，改善大鼠的學習記憶功能〔14〕。本研究結果說明TFHL可通過降低海馬神經元AChE活性、增強ChAT活性來增加腦組織乙酰膽堿含量，從而恢復膽堿能神經系統功能。

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