兩株抗肝癌細胞單鏈抗體三維結構的同源模建

葉 剛 鐘 健 湯紹輝 黃 衛 周 旻 盧筱華 楊冬華

(暨南大學附屬第一醫院消化內科，廣東 廣州 510632)

噬菌體抗體庫技術的發展使重組抗體的研究突飛猛進。其中，單鏈抗體(scFv)以其許多的優點而在腫瘤的診斷和治療方面引起廣泛重視。單鏈抗體是由抗體輕鏈和重鏈可變區通過一個短肽連接而成，具有親本抗體全部抗原結合特異性，其分子量小，容易進入病灶組織的周圍循環及在腎內清除快;缺少恒定區(Fc段)，不與具有Fc受體的非靶細胞結合，因此在體內定位診斷時背景低、圖像清晰，在腫瘤的影像分析、導向治療、新藥設計等多個領域具有巨大的應用價值。2001年本課題組采用噬菌體表面展示技術構建了庫容為2.1×105抗肝癌噬菌體單鏈抗體庫〔1〕，隨后在此基礎上成功將庫容擴大至5.3×107，并采用固相篩選法篩選出一株特異性抗肝癌的單鏈抗體HscFv 4-16〔2〕(GenBank 登錄號:DQ640759)。以 原始克 隆HscFv 4-16為模板，聯合采用錯配PCR、DNA改組和定點突變技術，獲得了高親和力的抗肝癌單鏈抗體DM〔3〕。為了解二個scFv三維結構的異同，本研究采用同源蛋白結構模建技術，模擬構建特異性抗肝癌單鏈抗體的三維結構，為進一步提高抗體親和力和人源化改造奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌細胞特異性單鏈抗體HscFv4-16和進行親和力成熟后的單鏈抗體DM的核苷酸序列均由本課題組提供。同源蛋白分析借助基因數據庫(EMBL+Genbank+DDBJ)，參考蛋白的結構坐標來源于蛋白質晶體結構數據庫(PDB)。所有分子模建、能量優化均在Sgi圖形工作站上，采用Accelrys公司的InsightⅡ98商用軟件包完成。

1.2 方法

1.2.1 確定抗體的一級結構 將肝癌細胞特異性單鏈抗體HscFv 4-16和DM的核苷酸序列轉變為氨基酸序列，并確定開放閱讀框(ORF)，去除載體序列的污染。

1.2.2 搜索同源結構參考蛋白 將VH、VL基因序列與基因數據庫(EMBL+Genbank+DDBJ)中已知的基因做同源性分析，確定VH和VL的同源結構參考蛋白。

1.2.3 確定VH和VL結構域的SCR區和LOOP區 用InsightⅡ的HOMOLOGY程序包，進行結構比對，通過主鏈碳原子Cα均方根位移(RMS)比較，結構疊合RMS＜1?的區域確定為參考蛋白的結構保守區(SCR)，結構疊合RMS＞1á的區域確定為結構可變區(LOOP區)。

1.2.4 scFv空間結構模建 將參考蛋白的SCR坐標賦值給目標蛋白相應的SCR;在環區結構庫中搜尋目標蛋白的非保守結構;完成側鏈安裝，修復N、C末端結構;在模建結構的兩對Cys殘基之間加上二硫鍵。

1.2.5 結構優化 采用能量極小化和分子動力學兩種方法使預測的結構在能量和物化上趨于合理。用InsightⅡ的DISCOVER程序包進行優化。對環區先后采用最陡下降法(Steepest Descent)和共軛梯度法(Conjugate gradient method))優化200步和5000步;再采用最陡下降法對側鏈進行優化。然后用 Dynamics進 行動 力學 模 擬，設 Equilibration=50，Temperature=300 K，Step=2000。最后用 Prostat〔4〕對優化后的結構進行合理性驗證。

2 結果

2.1 抗體的一級結構 HscFv 4-16和DM基因均為729 bp，均為一開放閱讀框，各編碼243個氨基酸。VH基因長363 bp，編碼121個氨基酸，VL基因長321 bp，編碼107個氨基酸，二者由編碼(Gly4Ser)3的45 bp的連接肽連接成VH-linker-VL。VH和VL基因中均有四個框架區(FRs)和三個互補決定區(CDRs)，以及維持抗體結構所必需的特征性的兩個半胱氨酸殘基，HscFv 4-16和DM的VH、VL的氨基酸序列均符合鼠抗體可變區特征。

2.2 同源結構參考蛋白的確定 綜合考慮同源性(ID)、分辨率、蛋白功能等，VH選擇了1A6W等10條重鏈作為候選結構模板，ID從70% ～74%，分辨率在1.5～2.7 ?。VL候選結構模板選擇了1AY1等7個抗體結構，ID在76% ～85%，分辨率在1.95～2.65 ?。蛋白類別均為抗體。將候選模板做結構比對，通過結構疊加，以RMS＜1 ?和m-block為標準，去除結構不匹配的模板。H1A6W、H1IQW和 H1QAX三者的 RMS為0.464 ?，m-block 包含 92.3% 殘基;L1AY1、L1BQL 和 L2IFF 三者的 RMS為0.466 ?，m-block包含91.6%殘基，最終分別被確定為HscFv 4-16和scFvDM的VH和VL的結構參考蛋白。通過序列比對，確定HscFv 4-16和scFvDM的VH和VL分別有個2個SCR區和1個LOOP區(圖1和圖2)。

2.3 模建VH和VL的空間構象 VH和VL各SCR區的主鏈坐標直接由同源性最高的同源蛋白相應的SCR區結構賦值生成。LOOP區主鏈碳原子Cα的空間構象是參照LOOP區前后保守區的Cα距離矩陣及LOOP區中氨基酸數目和類型，從結構數據庫搜索獲得。

2.4 模建完整scFv的空間構象 將已模建VH和VL的坐標賦值給scFv;再通過Loop Generate產生linker，linker從外側連接VH和VL，不影響結構;最后在結構中的CysH24與CysH98，CysL159與CysL223之間加上二硫鍵。這樣，就獲得了scFv4-16和scFvDM的初始三維結構。

2.5 結構優化 對初始結構進行分子力學和動力學優化后，scFv 4-16和scFv DM的RMS Derivative分別為0.0000538和0.0000463;測定結構的二硫鍵鍵長，優化前scFv 4-16的為3.1 ?和 2.54 ? 和 scFv DM 的為2.98 ? 和 2.81 ?，優化后前者的為 2.0 ? 和 1.99 ?，后者的為 1.99 ? 和 1.98 ?;用 Prostat驗證，模建的三維結構scFv 4-16和scFv DM的81.3%和79.8%的Φ和Ψ分布于Ramachandran圖的核心區域，模板1NQB的為83.2%，說明結構合理。

2.6 scFv 4-16和scFv DM的三維結構 按同源模建步驟模建獲得HscFv 4-16的三維結構(如圖3所示)與已知晶體結構的抗體結構類似，結構顯示VH和VL緊密結合在一起，Linker從結構的外側連接VH的C端和VL的N端，不影響抗體的構象(如圖4所示);鏈內由二硫鍵固定，VH和VL的二硫鍵分別位于CysH24與CysH92，CysL23與CysL88(Kabat編號)。圖5可見，HscFv 4-16結構六個CDR襻位于Fv段的N端，CDRL3和CDRH3，CDRL2和 CDRH2，CDRL1和CDRH1相對，圍成一個與抗原結合的疏水口袋，口袋深 15.6 ?。其中 CDRL3和CDRH3與抗原最接近，有較多接觸。scFvDM和HscFv 4-16的三維結構相似，scFv DM的CDRL3和CDRH3兩個襻比scFv 4-16的更靠近中央，口袋深16.1 ?。

圖1 VH與結構模板的序列比對

圖2 VH結構模板的結構疊加

圖3 HscFv 4-16三維結構飄帶圖側面觀(黃色為輕鏈FR區，藍色為重鏈FR區，紫色為CDR區，紅色為Linker)

圖4 HscFv 4-16三維結構飄帶圖頂面觀(黃色為輕鏈FR區，藍色為重鏈FR區，紫色為CDR區，紅色為Linker)

圖5 HscFv 4-16和scFv DM三維結構線形圖 (紅色為HscFv 4-16，藍色為scFv DM)

3 討論

蛋白質的功能與其空間結構有著密切的關系，因此，掌握蛋白質的結構信息對于研究蛋白質的功能及作用機制具有重要意義。X射線晶體學方法和多維核磁共振技術是目前測定蛋白質結構的主要方法，然而蛋白質結構的測定遠遠趕不上基因組測序速度。分子模擬技術為蛋白質的結構預測和功能測定提供了一種嶄新的手段，它在蛋白質的結構預測和模建工作中占有舉足輕重的地位〔5〕。蛋白質同源模建是目前公認最實用和可靠的蛋白結構預測技術。同源模建的理論依據是Anfinsen原理，即蛋白質分子的一級序列決定其三維空間結構。如果能在蛋白質結構數據庫中找到序列同源性大于30%的已知結構作模板，即可以進行一定程度的預測，特別是結構域部分的預測。

本實驗模建的HscFv 4-16的立體構象顯示，VH和VL分別由10個和9個β折疊組成兩個片層結構，由一個鏈內二硫鍵固定，六個CDR襻位于Fv段的N端，形成一個與抗原結合的空腔，深 15.6á。CDRH3和 CDRL3相對而立，位居中央，說明CDR3對抗體抗原結合的影響最大。因此選擇該區域的氨基酸殘基進行定點突變可能會對抗體功能產生重大影響。

本課題組以原始克隆HscFv 4-16為模板，經過4個重疊延伸PCR反應，依次引入 四個突變(按Kabat編號):CDRH1區H31(Phe→Ser)、CDRH3區 H100(Arg→Leu)、CDRL1區 L30(Ile→Thr)、CDRL3區L91(Trp→Arg)，從而獲得新突變體scFv DM。在對新突變體scFv DM相對親和力和特異性進行測定后發現，DM的抗原結合特異性不變，相對親和力則為原始克隆scFv 4-16的3.9倍〔3〕。研究已證實抗原與抗體結合的部位總在CDR表面的中央。從二者三維結構的重疊圖看，scFv DM的CDRL3和CDRH3兩個襻比HscFv 4-16的更靠近中央，疏水口袋比scFv 4-16的更深，其他區域幾乎完全重疊。由此可以從結構上解釋DM與抗原結合得更緊密，相對親和力較原始克隆scFv 4-16提高。

抗體和抗原的結合除了空間結構的相互適應外，疏水作用和靜電引力也起到重要的作用。Arg的側鏈在一般情況下都帶有電荷，常存在于蛋白質分子表面，能與相反電荷的基團形成鹽鍵，特別是容易與Glu或Asp形成鹽鍵，經常涉及活性位置〔6〕。CDRL3區 L91由 Trp→Arg，相鄰的 L90和 L92分別是Glu和Ser，它們之間產生的鹽鍵有助加強疏水作用。Ser和Thr具有短鏈的-OH基團的側鏈，而-OH基團可作為氫鍵的受體或者供體，因而它們(尤其是Ser)是化學上活潑的，常作為活性部位的殘基而具有十分重要的功能〔7〕。CDRH1區H31由Phe→Ser、CDRL1區 L30由Ile→Thr，親和力的提高可能還與Ser和Thr與相鄰骨架肽鍵基團-NH-或-C=O形成氫鍵有關。

本實驗采用蛋白質同源模建技術成功模建特異性抗肝癌單鏈抗體HscFv 4-16和scFv DM的三維結構。HscFv 4-16和scFvDM的抗原抗體結合部位由CDRH3和CDRL3，CDRH1和CDRL1圍成，其中CDRH3和CDRL3與抗原有較大接觸，功能氨基酸殘基應位于這一部位，因此選擇該區域的氨基酸殘基進行定點突變可能會對抗體功能產生重大影響。親和力成熟的實驗結果亦證實了這一推論，為抗體的人源化改造，和進一步提高抗體親和力打下了基礎。

1 畢向軍，楊冬華，崔 俊，等.抗肝癌單鏈抗體的構建及其結合特性〔J〕.上海免疫學雜志，2001;21(5):289-92.

2 周 旻，楊冬華，湯紹輝，等.集落挖掘法在抗肝癌噬菌體單鏈抗體庫篩選中的應用〔J〕.中國病理生理雜志，2005;21(6):1246-8.

3 盧筱華，楊冬華，湯紹輝，等.錯配PCR和DNA改組技術提高抗肝癌單鏈抗體親和力〔J〕.中國病理生理雜志，2006;22(6):1203-6.

4 Zhang Y，Li ZS，Sun M，et al.Molecular simulation studies of a seleniumcontaining scFv catalytic antibody that mimics glutathione peroxidase〔J〕.Biochim Biophys Acta，2005;1747(1):27-34.

5 劉 偉，丁祖泉，王 海.蛋白質結構與功能研究中的分子模擬技術〔J〕.上海生物醫學工程，2006;26(1):20-5.

6 Germain N，Mérienne K，Justin SZ，et al.Molecular and structural basis of the specificity of 6a neutralizing acetylcholine receptor-mimicking antibody，using combined mutational and molecular modeling analyses〔J〕.J Biol Chem，2000;275(28):21578-86.

7 Huang MD，Furie BC，Furie B.Crystal structure of the calcium-stabilized human factorⅨgla domain bound to a conformation-specific anti-factor IX antibody〔J〕.J Biol Chem，2004;279(14):14338-46.