肝癌組織中miR-200和Notch1蛋白表達的相關性

江小梅 彭杰文 (中山市人民醫院化療科，廣東 中山 528400)

小分子RNA(miRNA)對生命體的生長發育、增殖分化等基本生物學行為起著關鍵的調控作用，而其失衡表達亦可促進多種人類疾病尤其是腫瘤的發生發展，而且，一些miRNA在腫瘤發生的過程中本身即被認為擔當了癌基因或者抑癌基因的角色。miR-200與肝癌的發生及侵襲行為相關，可能發揮抑癌基因的功能。然而其發揮作用的機制目前尚不明確。本文通過對miR-200和Notch1蛋白表達進行相關性分析，初步探討Notch1蛋白是否為miR-200發揮腫瘤抑制作用的重要靶點。

1 材料與方法

1.1 標本收集 收集2008年1～12月間中山大學第一附屬醫院肝膽外科和中山市人民醫院肝膽外科手術患者肝癌組織標本和配對癌旁組織標本共36例，術前均未作放療、化療、免疫治療等抗腫瘤治療，每例標本均經病理醫師診斷為惡性腫瘤。所有標本手術切除后，置入液氮中－80℃保存備用。

1.2 分組 根據美國癌癥聯合委員會(AJCC)與國際抗癌聯盟(UICC)聯合制定的TNM分類及臨床分期，將上述病例分為:(1)臨床分期:Ⅰ期9例;Ⅱ期12例;Ⅲ期15例;Ⅳ期病例數少，統歸于Ⅲ期。(2)根據術前超聲、CT、術中探查情況、術后組織學檢查等分為:轉移組19例;非轉移組17例。

1.3 實時定量RT-PCR檢測miR-200表達 取肝癌標本100 mg，研磨成組織漿，采用TriZol試劑一步法提取總RNA;采用DU800型紫外分光光度計進行RNA濃度測定，對樣品濃度進行50倍稀釋，測定其光吸收值。逆轉錄合成cDNA，行定量PCR檢測;利用7500定量PCR儀所配SDS軟件分析數據。

1.4 Western印跡法檢測肝癌組織Notch1蛋白表達 稱取肝癌標本100 mg，提取總蛋白，吸取30 μg，加凝膠加樣緩沖液，煮沸10 min后上樣，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳;電轉移法將蛋白轉移至PVDF膜，甲醇固定，含5%脫脂奶粉的封閉液4℃過夜。一抗稀釋度為 1∶1000室溫孵育2 h，二抗稀釋度為1∶2000室溫孵育2 h后，ECL化學發光試劑盒處理并暗室顯影。以β-actin為內參照。運用Quantitive one軟件分析圖像，Notch1條帶與β-actin條帶的積分密度比值表示其蛋白水平。

1.5 統計學方法 采用SPSS12.0軟件進行方差分析和t檢驗，相關性采用Spearman等級相關檢驗。

2 結果

2.1 miR-200在肝癌組織中表達 miR-200在肝癌組織中表達量比在癌旁組織中表達低(2.83%vs 8.13%，P＜0.01);在不同臨床分期標本的表達隨著臨床分期的增加而減少(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期表達量分別為6.67%、3.89%、1.54%，P＜0.01);在轉移癌組織中的表達量比非轉移癌組織中低(1.83%vs 4.21%，P＜0.01)。

2.2 Notch1蛋白肝癌組織中表達 Western印跡檢測肝癌組織中Notch1蛋白表達，采用GAPDH作為內參照，目的蛋白和內參基因蛋白均獲得單一清晰條帶。結果顯示Notch1蛋白在癌旁組織、非轉移癌組織、轉移癌組織中的表達依次增加，差異顯著(P＜0.05)。見圖1。

2.3 Notch1蛋白表達和miR-200表達的相關性 Notch1蛋白表達和miR-200表達呈負相關(r=－0.684，P＜0.01)。

圖1 Notch1蛋白在轉移癌和非轉移癌組織中的表達

3 討論

大約70%～80%的HCC病人在晚期發現，一般經診斷后平均存活期為6個月，未經治療的病人5年生存率＜3%。盡管近年來隨著原發性肝癌早期診斷、早期治療和肝外科的進展，以手術切除為主，聯合全身化療、肝動脈栓塞化療、放療、免疫治療及中醫中藥等綜合療法，使肝癌的總體療效顯著提高，但是，肝癌的復發和轉移使得肝癌的治療難以取得較為理想的效果。小分子RNA的深入研究對于闡明腫瘤的發病機制及腫瘤的靶向治療有重要的意義，為中晚期肝癌患者的治療及改善肝癌患者的預后，提供新的途徑和希望。

本研究提示miR-200與肝癌的發生及侵襲行為相關，可能發揮抑癌基因的功能。然而，miR-200發揮作用的機制目前尚不明確。研究表明，miRNA可通過調控其靶基因參與的信號通路，影響腫瘤的發生和發展，發揮著類似于癌基因或抑癌基因的功能，是腫瘤基因治療的新靶點〔1，2〕。如:miR-21可通過下調抑癌基因PTEN，從而促進肝癌的增生、遷移和侵襲;低表達肝癌細胞系中miR-21后，則PTEN表達增加，腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力減弱;過表達肝癌細胞系中miR-21后，肝癌細胞其遷移潛能顯著增強〔3〕。研究表明，miRNA對靶基因的調控是在轉錄后水平上，通過對靶基因轉錄體的切割或對其翻譯抑制兩種機制來下調靶基因的表達。這兩種機制的選擇主要取決于它與靶基因轉錄體序列互補的程度，如果miRNA與靶基因轉錄體信使RNA有充分的互補，miRNA將通過切割方式來調控靶基因;如果miRNA與靶基因轉錄體信使 RNA沒有充分的互補，但有多個互補位點，那miRNA將通過翻譯抑制的方式來調控靶基因〔4，5〕;并且對靶基因翻譯的抑制需要多種 miRNA對同一靶基因的協同作用。在動物體內，大部分 miRNA不能與靶基因的轉錄體完全配對，故被認為主要通過翻譯抑制的方式來調控靶基因〔6〕。

miRNA靶基因的鑒定能為確定miRNA的功能提供直接證據，因此，尋找及鑒定新的miRNA癌基因或抑癌基因是干預腫瘤發生發展的關鍵。然而miRNA靶標基因的鑒定本身也是一個研究難點。植物的miRNA與靶基因幾乎完全配對結合，所以植物的miRNA靶基因鑒定相對直接和容易〔7〕。在動物中，miRNA與靶基因mRNA以不精確的堿基互補配對結合于3'端非翻譯區(3'-UTR)。另外，miRNA又是大約22 nt的小分子，所以單純通過序列相似性來鑒定動物體內的miRNA結合位點是相當困難的〔8〕。目前，有多個研究小組獨立開發了多種miRNA靶基因預測軟件〔9～10〕，利用生物信息學方法預測的miRNA的靶基因，如果加上miRNA的亞細胞定位，兩者結合可大大提高miRNA靶基因鑒定效率。

Notch1信號在腫瘤的發生和演進過程中有著重要作用。紊亂的Notch1信號不僅能夠直接引起腫瘤的發生，而且它可通過與其他多條信號通路的交互作用，以間接的方式最終誘導腫瘤形成。新的研究結果表明，Notch1主要在肝癌組織的胞質中表達，表達明顯高于癌旁組織中的表達，與我們的研究結果一致〔11〕;Notch1蛋白可調節Jurkat和HepG2細胞增殖，抑制其表達可抑制腫瘤細胞增殖〔12〕;下調Notch1的表達可引起肝癌細胞生長抑制和誘導肝癌細胞凋亡〔13〕;組成性活化Notch1可通過抑制蛋白酶降解而上調肝癌p53蛋白表達，Notch1蛋白可通過抑制Akt/Hdm2介導的p53降解以及上調p53依賴DR5表達，從而增加肝癌細胞對TRAIL誘導凋亡的敏感性〔14〕;胰島素樣生長因子(IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ)的活化可導致天冬氨酰-(天冬酰胺酰)β-羥化酶(AAH)和Notch1蛋白的過表達，從而使肝癌具有惡性表型〔15〕。最新的研究表明，下調miR-34a，miR-127及miR-16a表達，可靶向調控 E2F3，Notch1，BCL6，ZFHX1B 和BCL2蛋白表達水平，通過調節細胞凋亡、細胞增殖、細胞間連接以及上皮間質轉化等機制促進肝癌的發生發展〔16〕。

1 Kumar MS，Lu J，Mercer KL，et al.Impaired microRNA processing enhances cellular transformation and tumorigenesis〔J〕.Nat Genet，2007;39(5):673-7.

2 Papagiannakopoulos T，Kosik KS.MicroRNAs:regulators of oncogenesis and stemness〔J〕.BMC Med，2008;6(15):1-4.

3 Pogribny IP，Tryndyak VP，Boyko A，et al.Induction of microRNAome deregulation in rat liver by long-term tamoxifen exposure〔J〕.Mutat Res，2007;619(1-2):30-7.

4 Bartel DP.MicroRNAs:genomics，biogenesis，mechanism，and function〔J〕.Cell，2004;116(2):281-97.

5 Hutvágner G，Zamore PD.A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex〔J〕.Science，2002;297(5589):2056-60.

6 Olsen PH，Ambros V.The lin-4 regulatory RNA controls developmental timing in Caenorhabditis elegans by blocking LIN-14 protein synthesis after the initiation of translation〔J〕.Dev Biol，1999;216(2):671-80.

7 Rhoades MW，Reinhart BJ，Lim LP，et al.Prediction of plant microRNA targets〔J〕.Cell，2002;110(4):513-20.

8 Lewis BP，Shih IH，Jones-Rhoades MW，et al.Prediction of mammalian microRNA targets〔J〕.Cell，2003;115(7):787-98.

9 Sethupathy P，Megraw M，Hatzigeorgiou AG.A guide through present computational approaches for the identification of mammalian microRNA targets〔J〕.Nat Methods，2006;3(11):881-6.

10 Sethupathy P，Corda B，Hatzigeorgiou AG，et al.Tarbase:a comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets〔J〕.RNA，2006;12(2):192-7.

11 Gao J，Song Z，Chen Y，et al.Deregulated expression of Notch receptors in human hepatocellular carcinoma〔J〕.Dig Liver Dis，2008;40(2):114-21.

12 Suwanjunee S，Wongchana W，Palaga T，et al.Inhibition of gammasecretase affects proliferation of leukemia and hepatoma cell lines through Notch signaling〔J〕.Anticancer Drugs，2008;19(5):477-86.

13 Ning L，Wentworth L，Chen H，et al.Down-regulation of Notch1 signaling inhibits tumor growth in human hepatocellular carcinoma〔J〕.Am J Transl Res，2009;1(4):358-66.

14 Wang C，Qi R，Li N，et al.Notch1 signaling sensitizes tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells by inhibiting Akt/Hdm2-mediated p53 degradation and up-regulating p53-dependent DR5 expression〔J〕.J Biol Chem，2009;284(24):16183-90.

15 Cantarini MC，de la Monte SM，Pang M，et al.Aspartyl-asparagyl beta hydroxylase over-expression in human hepatoma is linked to activation of insulin-like growth factor and notch signaling mechanisms〔J〕.Hepatology，2006;44(2):446-57.

16 Tryndyak VP，Ross SA，Beland FA，et al.Down-regulation of the microRNAs miR-34a，miR-127，and miR-200b in rat liver during hepatocarcinogenesis induced by a methyl-deficient diet〔J〕.Mol Carcinog，2009;48(6):479-87.