經皮冠脈栓塞法建立豬急性心肌梗死模型及血清缺血修飾白蛋白的變化

王麗平 王紹欣 段娜娜 程建新 汪硯雨 王 可 劉相勇 魏利娟 孟雅麗

(河南科技大學第一附屬醫院心內科，河南 洛陽 471003)

心肌標志物的檢測在診斷急性心肌梗死(AMI)方面發揮著主要作用，2012年歐洲心臟病學會(ESC)在心肌梗死的定義中也強調了心肌標志物的地位。AMI患者由于就診時間不確定，早期檢測血清心肌標志物可能出現較大偏倚，而動物實驗可準確控制心肌梗死的時間點，真實反映心肌標志物的變化規律。近年研究表明血清缺血修飾白蛋白(IMA)是一個早期敏感的心肌缺血診斷指標，其敏感性顯著高于傳統的生化標志物〔1〕。本實驗通過經皮明膠海綿栓塞冠狀動脈法建立豬AMI模型并觀察IMA動態演變，為AMI的早期診斷提供臨床數據。

1 材料與方法

1.1 動物及主要儀器 中國動物試驗用中華小型豬16只，由江蘇泰州泰和生物科技有限公司提供。體重10～20 kg，同種同窩，雌雄不限。試驗過程中對動物的處理符合動物倫理學標準。介入材料(Guiding導管、微導管、6F動脈鞘管)、心電監護儀、除顫儀、麻醉藥品、搶救藥品、試劑盒、酶標儀等。

1.2 試驗方法術前禁食禁水8 h，肌注安定10 mg，5 min后，經豬耳緣靜脈用靜脈套管針建立靜脈通路，氯胺酮10 mg/kg緩慢靜推麻醉后，將小型豬仰臥位固定至導管床，靜推阿托品25 μg/kg抑制口腔分泌物，保持呼吸道通暢，呼吸機及除顫儀備用。連接心電監護電極及四肢導聯，心率160～200次/min。在手術過程中根據豬肢體活動情況靜脈輪流追加氯胺酮20 mg/次及地西泮(安定)5 mg/次，觀察生命體征，避免呼吸抑制。手術方法:①達到麻醉理想狀態后，常規消毒鋪巾，用橈動脈穿刺針以seldinger法穿刺豬右側股動脈，將6F橈動脈鞘植入豬股動脈，鞘內注射肝素10 000 U，以后每隔1 h追加2 000 U。②在X射線血管造影機下，采用左前斜45°，在J型導絲的引導下，送6F JR4.0Guiding導管至升主動脈根部測壓力165/130 mmHg，再分別進入左右冠狀動脈多體位造影，多體位投照，明確分析冠狀動脈分布。③將一Runthrough NS導絲送入回旋支遠端，送另一Runthrough NS導絲至OM支，沿此NS導絲送入微導管至鈍緣支，沿微導管緩慢勻速注入明膠海綿混懸液約2 ml，造成鈍緣支閉塞，行冠脈造影示鈍緣支血流中斷，成功建立心梗模型。④撤出NS導絲及微導管，在J型導絲引導下撤出指引導管，拔出橈動脈鞘，將鎖骨下靜脈管植入豬股動脈內，繃帶加壓包扎固定。⑤術后每天給予肝素3 000 U皮下注射，口服阿司匹林75 mg/d。

1.3 心肌標志物檢測 分別于術前及術后10 min、30 min、1、2、3、4、6、8、10、12、24、48 h 抽取豬耳緣靜脈血，在 30 min 內以3 000 r/min離心，分離出血清后放在－80℃的冰箱保存待用。用雙抗體夾心酶聯免疫吸附測定法(ELISA)檢測IMA，試劑盒由艾萊薩生物科技(上海)有限公司提供。嚴格按照試劑盒的說明書操作，用美國伯騰酶標儀完成測定。

病理檢查:分別于術后1、3、5、7、10 d將豬處死，取出心臟用0.9%生理鹽水灌洗干凈，置于40 g/L的甲醛液中固定7 d，于側壁及左室后壁梗死區、缺血區和正常區中心切取0.3 cm×0.3 cm的組織，分別用70%、80%、90%、95%、100%的乙醇脫水2～4 h，二甲苯透明30 min，再浸蠟、包埋，制成4 μm厚的石蠟切片，進行蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察。

1.4 統計學方法應用SPSS16.0軟件行重復測量方差分析。

2 結果

2.1 模型建立結果在AMI模型制作過程中共有15頭豬存活且達到AMI動物模型標準，其中1頭在模型制作完成后24 h因煩躁呼吸窘迫死亡，解剖后證實死于肺栓塞。

2.2 冠脈堵閉情況 15只豬成功完成冠脈造影，明膠海綿混懸液均成功注入LCX第一鈍緣支，見圖1。

圖1 冠狀動脈造影圖像

2.3 豬心電圖(ECG)變化 明膠海綿混懸液堵塞豬第一鈍緣支后ECG可見相關導聯ST段抬高，見圖2。

圖2 心電圖變化

2.4 IMA水平檢測 術前血清IMA水平為(37.8±0.16)U/ml在豬心梗模型建立成功10 min后血清IMA〔(70.1±0.19)U/ml〕開始迅速升高，30 min、1 h、2 h、3 h、4 h IMA 水平分別為(91.3±0.42)、(105.7±0.15)、(116.0±0.33)、(126.9±0.30)、(133.5±0.55)U/ml，6 h 達 到 峰 值 〔(142.6±0.39)U/ml〕，之后開始下降，術后 8、10、12、24 h IMA 水平分別為(131.7±0.41)、(122.1±0.32)、(102.0±0.53)、(41.6±0.60)U/ml，48 h時 IMA 在血中的濃度〔(31.9±0.38)U/ml〕接近正常范圍。

采用重復測量方差分析得出F值為1.019×104，各時間點IMA濃度與術前相比有統計學意義(P＜0.01);48 h時間點與術前比較無統計學意義(P＞0.05)。

2.5 病理檢測結果新鮮心臟標本可見14只豬心肌壞死部位基本一致，位于左室的側壁及后壁，梗死區室壁變薄顏色灰白，梗死隨時間的延長質地變硬凹陷。

蘇木素-伊紅染色顯示未梗死心肌細胞排列整齊、形態正常、分界清楚，細胞核位于中心，胞質染色均勻，心肌橫紋可見。梗死區在左室的側壁及后壁，光鏡下梗死區心肌細胞變性、胞質深染，核固縮消失，胞質溶解，肌纖維斷裂，纖維組織增生，橫紋模糊，各種細胞排列紊亂，炎性細胞浸潤。見圖3。

圖3 AMI模型病理改變(HE，×400)

3 討論

成功建立AMI動物模型可為心肌標志物的研究搭建一個良好的平臺。目前國內外多通過開胸結扎鼠、兔等小型動物的不同部位的冠狀動脈建立AMI動物模型，但開胸結扎手術復雜，創傷大，術后恢復慢、易感染、死亡率高，且小動物與人體的切合度偏低，不利于實驗研究。隨著介入治療技術的成熟及普及，經皮腔內冠狀動脈成形術建立AMI模型對動物創傷小、死亡率低、術后容易飼養、恢復較快。豬在生理特點、疾病發生和冠脈解剖結構方面與人類相近，血管內膜和心肌損傷的機制和恢復的時間也與人類相似〔2〕。本實驗采用seldinger法穿刺豬股動脈來建立心肌梗死模型創傷小，簡單易行，操作方便，可重復性強，國內外鮮有報道。

在AMI早期心肌缺血時，缺血心肌局部血流灌溉不足氧供減少，組織細胞反應性氧產物增多、酸中毒、自由基損害，細胞膜上的各種能量依賴性離子泵破壞等代謝變化，使血清白蛋白(HSA)的性質發生變化，氨基的N端的2～4個氨基酸殘基被氧化修飾產生了結構的改變，而導致了與過渡金屬結合能力下降，使HSA轉化為IMA。在心肌缺血或壞死早期，心肌壞死標志物均為陰性時，IMA作為高敏的缺血指標就可在血液中檢出，可以幫助AMI的早期診斷，以便在疾病的可逆期內進行危險分層及干預來改善患者的預后，減少病死率〔3〕。

IMA對心肌缺血有很高的靈敏度〔4，5〕。還可用于急性胸痛患者的排除診斷及AMI的危險分層〔6，7〕。既是心肌缺血開始時的敏感標志物，在AMI的排除診斷中發揮著重要的作用。

本實驗通過建立豬AMI模型，完整地反映了從心肌缺血到梗死的病理演變，客觀準確科學地反映了心肌酶的動態變化過程。本實驗發現，IMA在心肌梗死后10 min后迅速升高，6 h達到峰值，之后開始逐漸下降，約48 h降至正常。傳統的心肌標志物如cTnI、肌酸激酶同工酶(CK-MB)在診斷AMI方面都有較高的特異性，但多在心肌損傷后4～6 h后才會出現，在心肌缺血的可逆期內多檢測不到〔8〕。IMA高度的敏感性能在可逆期尚未發生心肌梗死情況下迅速檢測出心肌缺血及損傷，有助于急診室胸痛患者的早期診斷及排除急性心臟疾病，避免因漏診冠狀動脈病變而造成嚴重的后果。

IMA可隨血液循環于體內各個組織器官，在非心源性缺血的情況下如腦、肺、胃腸道和骨骼肌缺血時IMA也會增高，其特異性較低〔9〕。但其高度的敏感性適用于cTnI陰性且ECG正常的胸痛患者的心肌缺血或心肌梗死的排除診斷，所以在診斷AMI時應結合其他的心肌生化標志物、ECG及臨床癥狀體征來綜合分析，從而快速準確地診斷病情，讓患者得到及時有效的治療。現在主張AMI患者同時檢測cTn和IMA，提高AMI的靈敏度且可使確診的時間提前。

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